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meizhou

木虫 (知名作家)

[交流] 【求助/交流】蛋白质与蛋白质的关系研究

实验现象：实验中发现某细胞病理中有几种细胞骨架蛋白被降解了，同时也通过蛋白杂交和酶活测定发现了几种蛋白酶的活化。
求助交流问题1: 那么我能通过怎样的实验设计，或者通过哪些蛋白质与蛋白质的关系数据库能找到是哪种具体的酶降解了哪种具体的蛋白？（记得以前听说有做生物信息的同学，专门做数据库，只要输入两种蛋白氨基酸序列，就能预测它们关系的）
求助交流问题2: 前面所指的数据库查到的蛋白相互作用关系，除了纯化酶和底物进行孵育，然后进行测序实验外，是否还有其他渠道和设计去证明这些关系？
求助交流问题3: 我能否通过蛋白杂交的方式，把印迹出来的条带挖下来洗洗，打质谱得到氨基酸序列啊？如果不能，是否应该通过二维电泳，然后做斑点印迹再挖胶吗？

[ Last edited by meizhou on 2010-12-6 at 18:48 ]
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1楼 2010-12-06 18:46:15
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meizhou

木虫 (知名作家)
如果答得好，而且有文献佐证，俺还可以追加金币
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2楼2010-12-07 08:59:55
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
meizhou(金币+1):tx 2010-12-10 17:38:39
哎，帮顶吧~
期待高手
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5楼2010-12-09 23:09:55
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
meizhou(金币+3):是降解，在western blot上显示出现了小片段 2010-12-10 10:22:13
骨架蛋白被降解？
还是说解聚呢？
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6楼2010-12-09 23:57:11
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
meizhou(金币+10):谢谢 2010-12-10 11:42:50
问题1：我相信已经有些文献已经报道了这些蛋白酶和骨架的关系，你可以去查查

问题2：in vitro的生化反应是一个证据，同时你可以过表达或者干扰该蛋白酶，看能不能在非病理状态下引起降解或阻断病理模型的降解

问题3：其实做这个的意图是……？
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7楼2010-12-10 10:30:09
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meizhou

木虫 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 10:30:09:
问题1：我相信已经有些文献已经报道了这些蛋白酶和骨架的关系，你可以去查查

问题2：in vitro的生化反应是一个证据，同时你可以过表达或者干扰该蛋白酶，看能不能在非病理状态下引起降解或阻断病理模型的降解
...

问题1：同样一种细胞骨架蛋白，可能存在两种以上的蛋白酶可以水解它。如果是要确切地知道是哪一种酶起到的作用，是否应该对骨架蛋白降解片断进行测序呢？
问题2：我做的是死体模型，类似法医方面，根据死后细胞变化推理死亡时间的
问题3：我通过蛋白杂交，得知一个大蛋白被降解成两个小片段了，我想知道它是从哪个共价键断裂的，是哪种蛋白酶促进了这种断裂。

[ Last edited by meizhou on 2010-12-10 at 11:47 ]
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8楼2010-12-10 11:46:11
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meizhou

木虫 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-09 23:57:11:
骨架蛋白被降解？
还是说解聚呢？

SDS-PAGE会使蛋白变性，亚基分开，如果是解聚的话，在电泳上的显示结果，应该也是同样一个条带吧。
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9楼2010-12-10 11:49:49
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reasonspare

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
meizhou(金币+20):谢谢哥们 2010-12-10 12:31:10
dhd997(金币+3):good 2010-12-10 14:33:42
引用回帖:
Originally posted by meizhou at 2010-12-06 18:46:15:
实验现象：实验中发现某细胞病理中有几种细胞骨架蛋白被降解了，同时也通过蛋白杂交和酶活测定发现了几种蛋白酶的活化。
求助交流问题1: 那么我能通过怎样的实验设计，或者通过哪些蛋白质与蛋白质 ...

没有做过，帮你出出主意：


实验现象：实验中发现某细胞病理中有几种细胞骨架蛋白被降解了，同时也通过蛋白杂交和酶活测定发现了几种蛋白酶的活化。
求助交流问题1: 那么我能通过怎样的实验设计，或者通过哪些蛋白质与蛋白质的关系数据库能找到是哪种具体的酶降解了哪种具体的蛋白？（记得以前听说有做生物信息的同学，专门做数据库，只要输入两种蛋白氨基酸序列，就能预测它们关系的）

就是说你要看看能不能将骨架蛋白和你测到的蛋白酶能不能联系起来。
既然你已经知道是骨架蛋白，同多对你研究材料的了解，想必你能得到有关氨基酸序列，同样的道理你也能找到蛋白酶的信息，通过生物信息学的确可以进行预测，蛋白酶的各种结构域，但是推测的理论上的关系。

看来你也知道生物信息学，还处于发展阶段。




求助交流问题2: 前面所指的数据库查到的蛋白相互作用关系，除了纯化酶和底物进行孵育，然后进行测序实验外，是否还有其他渠道和设计去证明这些关系？

前面通过理论分析，下面是试验阶段。
纯化酶不是很必要，前提如果你已经知道有办法检测， 是否降解。

比如通过预测得到蛋白酶的催化位点：比如是Gly-Glu*-pro。那么你可以通过化学方方法对你的骨架蛋白进行甲基，或者其他修饰方法（生物素）进行标记，酶切后看结果。另外你可以先对你的蛋白酶行进确认研究，通过对已知蛋白（如ABS）进行验证。验证方法同上，然后再对你的骨架蛋白进行研究。


求助交流问题3: 我能否通过蛋白杂交的方式，把印迹出来的条带挖下来洗洗，打质谱得到氨基酸序列啊？如果不能，是否应该通过二维电泳，然后做斑点印迹再挖胶吗？

此法就为直接，有效。无论是是否进行双向电用，能够拿到分离骨架蛋白就行。
通过对你的蛋白酶进行同位素标记，利用质谱，TOF 或者ion trap 有ETD最好，可以获得蛋白酶的定量信息作为辅助信息。通过分析酶，骨架蛋白的复合体，就能知道骨架蛋白的aa 序列。通常2-5多肽就能确定一个蛋白了。
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10楼2010-12-10 12:00:02
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
dhd997(金币+2):热心鼓励之。 2010-12-10 14:34:11
引用回帖:
Originally posted by meizhou at 2010-12-10 11:49:49:

SDS-PAGE会使蛋白变性，亚基分开，如果是解聚的话，在电泳上的显示结果，应该也是同样一个条带吧。

是的
但是你也要考虑一个这样的问题，蛋白质放久了，也会自发降解，不仅仅是骨架降解而已
我用组织样品做过WB，actin也会成一坨或者几坨带的
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11楼2010-12-10 12:11:55
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meizhou

木虫 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 12:11:55:


是的
但是你也要考虑一个这样的问题，蛋白质放久了，也会自发降解，不仅仅是骨架降解而已
我用组织样品做过WB，actin也会成一坨或者几坨带的

是的，放久了就是内源蛋白酶把它水解了，我做的细胞骨架中，正好也有actin，呵呵
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12楼2010-12-10 12:28:31
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by meizhou at 2010-12-10 12:28:31:


是的，放久了就是内源蛋白酶把它水解了，我做的细胞骨架中，正好也有actin，呵呵

我的意思是，这些降解到底是保存不当或者自发的降解，还是确实是病理状态下的降解
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13楼2010-12-10 13:59:11
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meizhou3楼
2010-12-08 11:02   回复  
meizhou4楼
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