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qingqingcao288

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌表达系统蛋白酶对目的蛋白的水解问题 已有5人参与

如题,在E.coli BL21(DE3)中做目的基因的克隆表达,SDS-PAGE分析居然有三条很深的条带,与其他对照相比,这三条带都不是背景带,也就是感觉目的基因有被切掉了一部分,各位有了解大肠杆菌表达系统的蛋白酶以及酶切位点的没?欢迎解答,万分感激。
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yw_1009

铁虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by qingqingcao288 at 2010-11-28 21:35:25:
再顶个,如果是蛋白酶降解了,大肠杆菌细胞内通常可以有哪些蛋白酶会降解异源蛋白呢?他们的切点又是怎么样的呢?了解了之后可以进行定点突变改掉。

同问
大肠杆菌中是否有菌体本身的蛋白酶会把表达蛋白降解呢,有了解的吗?望解答!
10楼2012-01-11 02:14:33
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普通回帖

小白兄

金虫 (小有名气)

qingqingcao288(金币+1): 2010-05-18 18:36:09
也可能是蛋白降解了,有可能是你超声的时候过于剧烈使蛋白断裂了。还是看图比较清楚。你超声时间和次数是怎么设定的?
时光如流水,匆匆而过。
2楼2010-05-17 23:53:52
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lifeip

至尊木虫 (知名作家)

qingqingcao288(金币+1): 2010-05-18 12:35:36
多出的条带比目标条带大还是小?如过比预期条带待大,或许有可能形成了多聚体,看他们分子量是否呈倍数关系,如果小,则可能蛋白降解了。
3楼2010-05-18 00:20:27
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todouhy

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 小白兄 at 2010-05-17 23:53:52:
也可能是蛋白降解了,有可能是你超声的时候过于剧烈使蛋白断裂了。还是看图比较清楚。你超声时间和次数是怎么设定的?

其实我一直有这个问题想要问啊,就是超声波设定额时候破包时间到底多少为宜啊,我知道是不能超过30分钟,一般如果是1.5ml菌液离心之后加入200ul缓冲液拿去破胞的话,要多久呢,我一般是工作时间2min,破十秒,休息十秒,呵呵!
4楼2010-05-18 00:29:52
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qingqingcao288

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 小白兄 at 2010-05-17 23:53:52:
也可能是蛋白降解了,有可能是你超声的时候过于剧烈使蛋白断裂了。还是看图比较清楚。你超声时间和次数是怎么设定的?

我的是胞外蛋白,没有做超声,呵呵
5楼2010-05-18 08:59:31
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chengkun

金虫 (正式写手)

qingqingcao288(金币+1): 2010-05-18 18:36:34
其实破碎大肠我的感觉是不一定非要用超声破碎,反复冻容效果也较好,您不妨试一下。
6楼2010-05-18 09:14:17
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小白兄

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by chengkun at 2010-05-18 09:14:17:
其实破碎大肠我的感觉是不一定非要用超声破碎,反复冻容效果也较好,您不妨试一下。

反复冻容是不是时间太长了啊?我没做过,可以交流下
时光如流水,匆匆而过。
7楼2010-05-18 23:29:43
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小白兄

金虫 (小有名气)

qingqingcao288(金币+2): 2010-05-19 21:46:38
引用回帖:
Originally posted by todouhy at 2010-05-18 00:29:52:

其实我一直有这个问题想要问啊,就是超声波设定额时候破包时间到底多少为宜啊,我知道是不能超过30分钟,一般如果是1.5ml菌液离心之后加入200ul缓冲液拿去破胞的话,要多久呢,我一般是工作时间2min,破十秒,休 ...

这个跟你的超声功率有关,一般我用的是200-220w,你1.5ml菌液3,3,20次就差不多了。如果你蛋白够坚挺超声时间长点没关系。一般超声时间过长会使蛋白断裂或者变性。
时光如流水,匆匆而过。
8楼2010-05-18 23:33:25
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qingqingcao288

木虫 (小有名气)

再顶个,如果是蛋白酶降解了,大肠杆菌细胞内通常可以有哪些蛋白酶会降解异源蛋白呢?他们的切点又是怎么样的呢?了解了之后可以进行定点突变改掉。
9楼2010-11-28 21:35:25
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