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[交流]
【求助/交流】透明圈大小和蛋白酶浓度的关系
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| 我想做透明圈大小和蛋白酶浓度关系的标准曲线。我想求助具体的方法，是将不同浓度的蛋白酶滤纸片贴在酪蛋白培养基上，然后培养一段时间测量透明圈大小吗？ |
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2楼2011-04-13 16:23:45
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rainwander(金币+2): 鼓励交流~~~ 2011-04-13 17:15:42
rainwander(金币+2): 鼓励交流~~~ 2011-04-13 17:15:42
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我做了近一年的纤维素酶产生菌筛选工作。主要是利用刚果红进行筛选。初筛是主要以H/D进行筛选，但是，这不准确，准确的掌握酶活，则需要进行发酵复筛。 水解圈可以从一定程度上反应菌落酶活性的大小。 但是，比水解圈更为准确的是水解圈直径/菌落直径的比值可以更好的指示蛋白酶酶活性的高低。 但是，这种关系，并不是非常精确的，如果真的要精确，需要进一步测定酶活。 虽然H/D不精确，但是，在大规模筛选或者工作量较大时，不失为一个有效的判断方法。 [ Last edited by mche2005 on 2011-4-13 at 17:41 ] |
3楼2011-04-13 16:32:08
冼亮淀粉酶
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★ ★ ★
rainwander(金币+3, EPI+1): 鼓励交流~~~ 2011-04-13 17:16:22
rainwander(金币+3, EPI+1): 鼓励交流~~~ 2011-04-13 17:16:22
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没必要纠缠在平板透明圈与酶活力高低的关系这个问题上，没有相关性的。我硕士论文上对这个问题有讨论，与蛋白酶产生菌的筛选道理是相通的。 4.2关于淀粉降解微生物的筛选方法 在菌种初筛时依据在含淀粉平板上产生降解圈来判断微生物是否产淀粉酶，一般认为H/D值高即产酶活力高，比值小就被淘汰。但本工作发现H/D值值的大小与产酶活力的高低之间并没有明显的相关性，有的H/D值虽然不大，但液体培养时酶活并不低。所以，淀粉酶产生菌产淀粉酶活力的高低应以多次液体培养摇瓶发酵测酶活的复筛验证为准。 个人推测H/D值的高低可能与以下因素有关： ①淀粉平板的厚薄：相对于同一个微生物来说，在培养条件相同的情况下，由于产酶量一定，故平板越厚H/D值越小，平板越薄H/D值越大； ②平板的形状：由于培养皿在生产过程中不可能做到完全一致，所以造成很多培养皿的底部不是完全平整的，甚至有较大变形，这样就会造成在同一块淀粉平板上培养基的厚薄不一致，引起系统误差； ③各种微生物所产淀粉酶在淀粉平板上的稳定性不一致，产胞外蛋白酶活力的高低也不一致。有的微生物所产淀粉酶比较稳定，就能在平板上存活较久，有利于形成较大的H/D值。或者有的微生物所产蛋白酶活力较低，对淀粉酶的降解作用较弱，这也有利于形成较大的H/D值。 产淀粉酶时间早晚不一致，早产酶则酶对淀粉的降解时间长，利于产生较大的降解圈。 |
4楼2011-04-13 16:32:40
5楼2011-04-13 17:37:28
冼亮淀粉酶
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wolfebst(金币+2): 谢谢讨论 2011-04-16 16:36:07
wolfebst(EPI+1): 2011-04-16 21:10:05
wolfebst(金币+2): 谢谢讨论 2011-04-16 16:36:07
wolfebst(EPI+1): 2011-04-16 21:10:05
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“产酶早，往往产酶时间短，既然时间短，那么，降解圈就不一定大了。” 我想知道你为什么说“往往”，因为你的结论“降解圈就不一定大了”是以“既然时间短”为前提的，所以我在意你的“往往”的出处。如果有什么文献或者实验支持，我想学习一下。 你的附件我下载看了，发现字迹模糊，在实验步骤里有用手写的字，我想知道是出自哪本书，哪一年出版，第一版是哪一年。 另外，附件中关于蛋白质筛选的论述主要集中于一个菌株诱变产生酶活力提高的突变株的筛选，并非从环境样品中筛选，环境样品中含有的微生物种类繁多，产酶种类更多，不同于同一个菌株诱变得到的突变株筛选，产酶种类就只看菌株基因组内有多少个这个酶的基因了，假如就只有一个，那么整个基因组那么大，突变发生在酶的基因序列上的可能性就少了。所以说这个酶的种类也是值得考虑的。请看楼主之前发帖 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3044192 附件中提到降解圈径比不与酶活力严格相关，应以发酵产酶为最终标准，这与我的看法是一致的。请看附件中第四页的70%和第八页的65%。而且附件中关于培养基的厚薄和培养皿底部的形状也有与我相似的论述，请看第四页尾部和第五页开始部分。 关于平板降解圈的可能性很多，内肽酶和外肽酶对降解圈的贡献也是不一样的。你说的“产酶早，但是产酶时间短，降解圈不一定大”也是可能存在的。 最后总结，对于同一个菌株诱变株的筛选，可以比较严格按照降解圈径比来初筛，但是对于筛选环境样品中的微生物，不必拘泥于降解圈径比，要把标准稍微放宽一些，某些径比不大的微生物也要放过，进入到下一步的复筛，以免漏过真正的高产菌株。 [ Last edited by 冼亮淀粉酶 on 2011-4-16 at 16:43 ] |
6楼2011-04-16 16:33:20
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