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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】HRM技术的几个问题
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】HRM技术的几个问题

我搜索了些HRM的资料看,现在还有些不明白的地方:
1。溶解曲线的差异是根据碱基含量的不同，那么就要求个样品的DNA含量一致才不会影响结果，我提取的是外周血DNA，那么如何保证DNA含量的一致呢？
2。对于一对引物，需不需要要求T m值差异要大些？引物是不是和普通PCR 的引物一样呢？
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1楼 2010-12-15 16:13:25
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lovenlong

铜虫 (小有名气)

我做HRM的几点认识！

★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+4):辛苦~~欢迎常来生物版交流 2010-12-16 00:00:15
xwsooo(金币+1):灰常感谢 2010-12-16 08:10:21
1.要保证PCR体系的一致性，把相同的反应物混合后分装，最后加有差异的成分（一般是DNA或引物），稍微甩一下，上面滴点矿物油（Mineral Oil,SIGMA M5904）.
2.DNA用量不要太多（10微升一般10~30ng），定量稀释差不多同一个浓度就可以了。一般你提的方法很仔细的话，浓度都挺高的，那稀释个几十到几百倍那纯度也很高了。
3.特异性的问题：引物Tm值稍微高点比较好，我一般23nt以上的引物跑的；用好点的酶，最好是HotStart的，我用TAKARA的Taq Hotstart Version (250U,RMB 350)效果不错，反应体系也不用怎么优化的。
4.关于荧光染料，推荐用EvaGreen(1ml RMB 400),LC green 太贵（1ml RMB 1400~1700）,其实好像没什么差别的，而且用10微升的体系0.8微升就够了。染料会使引物Tm值上升一点点。
5.扩增片段的GC 含量要注意，如果GC比较高，那HRM分析的温度区域可能很高，一般不要超过95度~
我有一个单碱基差异的两份水稻材料，目前测试的结果分辨率还不错，接下来就是大规模扫描的应用了。有需要这两个DNA来测试的虫友可以一起交流交流~本人广州华南农业大学的~
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8楼2010-12-15 20:26:33
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普通回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)
看晕我了，没看明白你的意思
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2楼2010-12-15 16:22:36
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-15 16:22:36:
看晕我了，没看明白你的意思

不好意思，我现在先自我解释一下 ，首先HRM技术的精确性受到不同标本中DNA浓度的影响，所以必须先保证DNA 浓度的一致，方法有，用紫外分光光度计测量吸光度，用TE稀释至1.0.
第二，与两条引物的tm差应该无关吧。但我还不明白的是HRM需不需要设计特异性引物，有别于普通PCR引物设计的那种？？/
最后都说HRM成本低，那我想了解如果做500份标本，那么大概要花多少RMB?
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3楼2010-12-15 17:03:02
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 16:13:25:

我提取的是外周血DNA，那么如何保证DNA含量的一致呢？
  

上边这句话啥意思
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4楼2010-12-15 17:09:29
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hfkset

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
xwsooo(金币+1):灰常感谢 2010-12-15 18:28:59
rainwander(金币+3):哈哈啊，差不多就这样，染料是挺贵的..... 2010-12-15 18:38:11
ＨＲＭ要求ＤＮＡ浓度一样，但也不用太精确，跑胶看着差不多就行，引物和普通ＰＣＲ引物一样，不用特殊的。至于成本，染料比较贵，１０００ｕｌ，１３００ＲＭＢ
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5楼2010-12-15 17:19:46
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xwsooo

银虫 (小有名气)
rainwander:卖这个仪器的地，有卖染料的，你问问~~ 2010-12-15 18:38:51
引用回帖:
Originally posted by hfkset at 2010-12-15 17:19:46:
ＨＲＭ要求ＤＮＡ浓度一样，但也不用太精确，跑胶看着差不多就行，引物和普通ＰＣＲ引物一样，不用特殊的。至于成本，染料比较贵，１０００ｕｌ，１３００ＲＭＢ

不知道这染料1000微升是什么意思，能做多少份标本呢 ？
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6楼2010-12-15 18:30:50
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xwsooo

银虫 (小有名气)
还有一个问题，HRM的内参怎么加，因为 一管只能检测一个产物，那么内参得在另外一管，那这样的也算是内参吗？
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7楼2010-12-15 18:47:21
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lovenlong

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 18:47:21:
还有一个问题，HRM的内参怎么加，因为 一管只能检测一个产物，那么内参得在另外一管，那这样的也算是内参吗？

楼上兄弟是否做定量的？定量不是很懂，看你是相对还是绝对定量吧？！
好像HRM不需要内参。。。
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9楼2010-12-15 20:28:30
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hfkset

铜虫 (初入文坛)
xwsooo(金币+1): 2010-12-17 17:21:40
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 18:30:50:


不知道这染料1000微升是什么意思，能做多少份标本呢 ？

我买的是1管1000ul的包装，15ul PCR体系，1-2ul染料
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10楼2010-12-17 13:24:51
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hfkset at 2010-12-17 13:24:51:

我买的是1管1000ul的包装，15ul PCR体系，1-2ul染料

不知道您用过roche 的480仪器做过么，效果好么
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11楼2010-12-17 17:23:42
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sutao1979

木虫 (著名写手)
xwsooo(金币+1):灰常感谢 2010-12-18 09:47:28
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 16:13:25:
我搜索了些HRM的资料看,现在还有些不明白的地方:
1。溶解曲线的差异是根据碱基含量的不同，那么就要求个样品的DNA含量一致才不会影响结果，我提取的是外周血DNA，那么如何保证DNA含量的一致呢？
2。对于一对引物 ...

你说的应该是SNP差异分析吧，用HRM系列的qpcr机器确实可以分辨，原理是根据melting curve的差异来分辨单个碱基的变化。但是，分辨差异并不需要DNA含量完全一致，如果一致也就是通常的spectrophotometre测就可以了，然后换算一下;引物没有特殊要求，保证没有dimer，crossing dimer就ok了，不然有干扰。
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12楼2010-12-18 00:49:47
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sutao1979 at 2010-12-18 00:49:47:


你说的应该是SNP差异分析吧，用HRM系列的qpcr机器确实可以分辨，原理是根据melting curve的差异来分辨单个碱基的变化。但是，分辨差异并不需要DNA含量完全一致，如果一致也就是通常的spectrophotometre测就可 ...

我又突然想起一个问题,HRM分辨的是不同链中碱基含量的变化,如果扩增的片断里含有多个SNP位点呢?我怎么鉴定我所需要的SNP的基因型呢？？？
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13楼2010-12-18 22:48:44
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kidluag

金虫 (正式写手)
学习中
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14楼2012-06-07 03:25:26
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
952781楼: Originally posted by lovenlong at 2010-12-15 20:26:33
1.要保证PCR体系的一致性，把相同的反应物混合后分装，最后加有差异的成分（一般是DNA或引物），稍微甩一下，上面滴点矿物油（Mineral Oil,SIGMA M5904）.
2.DNA用量不要太多（10微升一般10~30ng），定量稀释差不多 ...

我刚做HRM实验，也遇到楼主一样的困惑。想请教一下，模板的质量对PCR的影响大吗？一般如何保证模板的一致性？你的PCR体系是如何优化的？
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15楼2012-12-17 23:07:16
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
944645楼: Originally posted by hfkset at 2010-12-15 17:19:46
ＨＲＭ要求ＤＮＡ浓度一样，但也不用太精确，跑胶看着差不多就行，引物和普通ＰＣＲ引物一样，不用特殊的。至于成本，染料比较贵，１０００ｕｌ，１３００ＲＭＢ

DNA的浓度有怎样的要求，是在一个数量级上就可以吗？
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16楼2012-12-17 23:09:32
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
1036106楼: Originally posted by sutao1979 at 2010-12-18 00:49:47
你说的应该是SNP差异分析吧，用HRM系列的qpcr机器确实可以分辨，原理是根据melting curve的差异来分辨单个碱基的变化。但是，分辨差异并不需要DNA含量完全一致，如果一致也就是通常的spectrophotometre测就可以 ...

弱弱的请教一下：我现在用HRM作SNP分型，除了模板不同，体系都一样，模板根据紫外分光光度计测OD然后稀释到相同的浓度，可是分型出现了好多组（正常的应该3组），不知道是什么原因，是模板的质量引起的吗？还有，做HRM实验的PCR体系如何优化？现在很茫然···
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17楼2012-12-17 23:13:50
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kidluag

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我是搞突变体库的，想要找一个有HRM LightScanner或者其他相关仪器的地方对我已经PCR的产物进行分析，当然可以付费分析的，不知道楼主知不知道这类地方，楼主您那有没有相关仪器可以付费使用的呢？
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18楼2013-01-30 14:42:39
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kidluag

金虫 (正式写手)
我是搞突变体库的，想要找一个有HRM LightScanner或者其他相关仪器的地方对我已经PCR的产物进行分析，当然可以付费分析的，不知道楼主知不知道这类地方，楼主您那有没有相关仪器可以付费使用的呢？拜托大侠了
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19楼2013-01-30 14:49:08
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渭水凡夫

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 18:30:50
不知道这染料1000微升是什么意思，能做多少份标本呢 ？...

每个样只需加0.2ul  1k3的染料 估计是LCgreen    样多的话  推荐用KIT  带染料  比较划算
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20楼2013-12-04 23:24:47
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misszwh

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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13楼: Originally posted by xwsooo at 2010-12-18 22:48:44
我又突然想起一个问题,HRM分辨的是不同链中碱基含量的变化,如果扩增的片断里含有多个SNP位点呢?我怎么鉴定我所需要的SNP的基因型呢？？？...

我们一般做单个SNP位点。如果2个也可以，主要根据碱基间结合能力的强弱，结合强的TM值高，结合弱的TM值低。
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21楼2014-02-25 22:50:16
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misszwh

银虫 (小有名气)
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16楼: Originally posted by 欧朵拉 at 2012-12-17 23:09:32
DNA的浓度有怎样的要求，是在一个数量级上就可以吗？...

我们都是稀释到同一个浓度。
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22楼2014-02-25 22:50:52
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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8楼: Originally posted by lovenlong at 2010-12-15 20:26:33
1.要保证PCR体系的一致性，把相同的反应物混合后分装，最后加有差异的成分（一般是DNA或引物），稍微甩一下，上面滴点矿物油（Mineral Oil,SIGMA M5904）.
2.DNA用量不要太多（10微升一般10~30ng），定量稀释差不多 ...

你做HRM PCR的时候样品做复孔吗？
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23楼2015-08-17 14:59:45
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 18:30:50
不知道这染料1000微升是什么意思，能做多少份标本呢 ？...

如果你要配10uL的反应体系的话，一个样品只需5uL染料。
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24楼2015-08-17 15:01:56
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