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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】HRM技术的几个问题
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】HRM技术的几个问题

我搜索了些HRM的资料看,现在还有些不明白的地方:
1。溶解曲线的差异是根据碱基含量的不同，那么就要求个样品的DNA含量一致才不会影响结果，我提取的是外周血DNA，那么如何保证DNA含量的一致呢？
2。对于一对引物，需不需要要求T m值差异要大些？引物是不是和普通PCR 的引物一样呢？
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1楼 2010-12-15 16:13:25
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lovenlong

铜虫 (小有名气)

我做HRM的几点认识！

★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+4):辛苦~~欢迎常来生物版交流 2010-12-16 00:00:15
xwsooo(金币+1):灰常感谢 2010-12-16 08:10:21
1.要保证PCR体系的一致性，把相同的反应物混合后分装，最后加有差异的成分（一般是DNA或引物），稍微甩一下，上面滴点矿物油（Mineral Oil,SIGMA M5904）.
2.DNA用量不要太多（10微升一般10~30ng），定量稀释差不多同一个浓度就可以了。一般你提的方法很仔细的话，浓度都挺高的，那稀释个几十到几百倍那纯度也很高了。
3.特异性的问题：引物Tm值稍微高点比较好，我一般23nt以上的引物跑的；用好点的酶，最好是HotStart的，我用TAKARA的Taq Hotstart Version (250U,RMB 350)效果不错，反应体系也不用怎么优化的。
4.关于荧光染料，推荐用EvaGreen(1ml RMB 400),LC green 太贵（1ml RMB 1400~1700）,其实好像没什么差别的，而且用10微升的体系0.8微升就够了。染料会使引物Tm值上升一点点。
5.扩增片段的GC 含量要注意，如果GC比较高，那HRM分析的温度区域可能很高，一般不要超过95度~
我有一个单碱基差异的两份水稻材料，目前测试的结果分辨率还不错，接下来就是大规模扫描的应用了。有需要这两个DNA来测试的虫友可以一起交流交流~本人广州华南农业大学的~
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8楼2010-12-15 20:26:33
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
看晕我了，没看明白你的意思
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2楼2010-12-15 16:22:36
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-15 16:22:36:
看晕我了，没看明白你的意思

不好意思，我现在先自我解释一下 ，首先HRM技术的精确性受到不同标本中DNA浓度的影响，所以必须先保证DNA 浓度的一致，方法有，用紫外分光光度计测量吸光度，用TE稀释至1.0.
第二，与两条引物的tm差应该无关吧。但我还不明白的是HRM需不需要设计特异性引物，有别于普通PCR引物设计的那种？？/
最后都说HRM成本低，那我想了解如果做500份标本，那么大概要花多少RMB?
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3楼2010-12-15 17:03:02
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 16:13:25:

我提取的是外周血DNA，那么如何保证DNA含量的一致呢？
  

上边这句话啥意思
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4楼2010-12-15 17:09:29
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