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[交流]
【求助/交流】HRM技术的几个问题
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我搜索了些HRM的资料看,现在还有些不明白的地方: 1。溶解曲线的差异是根据碱基含量的不同，那么就要求个样品的DNA含量一致才不会影响结果，我提取的是外周血DNA，那么如何保证DNA含量的一致呢？ 2。对于一对引物，需不需要要求T m值差异要大些？引物是不是和普通PCR 的引物一样呢？ |
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我做HRM的几点认识！
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lstt09nk(金币+4):辛苦~~欢迎常来生物版交流 2010-12-16 00:00:15
xwsooo(金币+1):灰常感谢 2010-12-16 08:10:21
lstt09nk(金币+4):辛苦~~欢迎常来生物版交流 2010-12-16 00:00:15
xwsooo(金币+1):灰常感谢 2010-12-16 08:10:21
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1.要保证PCR体系的一致性，把相同的反应物混合后分装，最后加有差异的成分（一般是DNA或引物），稍微甩一下，上面滴点矿物油（Mineral Oil,SIGMA M5904）. 2.DNA用量不要太多（10微升一般10~30ng），定量稀释差不多同一个浓度就可以了。一般你提的方法很仔细的话，浓度都挺高的，那稀释个几十到几百倍那纯度也很高了。 3.特异性的问题：引物Tm值稍微高点比较好，我一般23nt以上的引物跑的；用好点的酶，最好是HotStart的，我用TAKARA的Taq Hotstart Version (250U,RMB 350)效果不错，反应体系也不用怎么优化的。 4.关于荧光染料，推荐用EvaGreen(1ml RMB 400),LC green 太贵（1ml RMB 1400~1700）,其实好像没什么差别的，而且用10微升的体系0.8微升就够了。染料会使引物Tm值上升一点点。 5.扩增片段的GC 含量要注意，如果GC比较高，那HRM分析的温度区域可能很高，一般不要超过95度~ 我有一个单碱基差异的两份水稻材料，目前测试的结果分辨率还不错，接下来就是大规模扫描的应用了。有需要这两个DNA来测试的虫友可以一起交流交流~本人广州华南农业大学的~ |
8楼2010-12-15 20:26:33
2楼2010-12-15 16:22:36
3楼2010-12-15 17:03:02
4楼2010-12-15 17:09:29