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义翘神州

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[交流] CAR表达怎么测？定点荧光标记蛋白让流式细胞检测更直接

car-t、car-nk等工程化免疫细胞完成靶基因导入后，需要面临一个简单却十分关键的问题：car是否成功在细胞表面表达？car只有经过正确表达、折叠并定位至细胞膜，才能通过胞外抗原识别结构域与靶抗原结合。流式细胞术常用于检测car细胞阳性率和表达情况。
体内（in vivo）car-t技术是近来细胞免疫研究的热点，直接在患者体内原位编程t细胞，省去体外加工步骤。car-t细胞的动态分布、扩增效率、功能持久性、药代动力学等精准检测，直接关系剂量优化、安全性评估及疗效预测。深入理解并优化这种“活细胞药物”在体内的行为是当前研究的重点。
定点标记蛋白作为重要的监测与分析工具，在car阳性检测中具有重要应用。义翘神州定点标记重组蛋白产品，精准位点标记，显著提升检测的灵敏度、特异性与准确性，有助于加速car-t的临床转化与产业化进程。

01 用于car检测的流式细胞术
流式细胞术（fcm）已广泛用于血液中淋巴细胞亚群的检测，比如使用荧光标记试剂测定分析细胞特性。fcm贯穿car-t产品的研发、生产全过程。fcm与其他技术组合，用于检测car-t细胞的转导效率、阳性率、表型等关键质量属性。car-t的功能表征包括细胞增殖、脱颗粒、细胞因子释放等。在完成输注后，还可用fcm监测外周血或骨髓样本中car-t细胞的数量和表型，评估药代动力学，表征细胞分化、活化、耗竭或衰老相关的生物标志物。
流式细胞术检测的关键是试剂。有多种car-t检测试剂供选择，比如非特异性试剂protein l、人源igg铰链区抗体，靶点特异性试剂工程化重组抗原、荧光标记抗原，car构建特异性试剂scfv抗独特型抗体、连接肽（g4s linker）抗体等。

（源自文献：doi: 10.1002/cyto.b.70026）

02 荧光标记蛋白：让流式细胞检测更直接
在众多car检测试剂中，荧光标记的靶抗原蛋白直接利用car与抗原之间的特异性结合进行检测。以靶向bcma的car-t细胞为例，将荧光标记的bcma重组蛋白与细胞孵育，正确表达于细胞表面的car能识别抗原构象，通过胞外结构域与荧光标记蛋白结合。通过流式细胞术检测荧光信号，就可以分析car-t细胞阳性率和相对表达水平。
从检测原理上，重组蛋白与protein l、igg铰链区抗体或linker抗体不同，其直接识别car的抗原结合位点，用于检测已经定位于细胞表面、保持靶抗原结合能力的car。如果使用未标记的重组蛋白，还需要通过标签抗体或其他二级检测试剂产生荧光信号，可能会带来非特异性结合与背景信号。荧光标记蛋白可用于car细胞转导效率、表达情况分析，还可以结合细胞表型、活化状态等其他流式指标进行多参数检测。
demaret等人建立了一种基于荧光标记cd19蛋白的流式检测方法，用于监测cd19 car-t细胞。研究以yescarta输注产品及28例患者的外周血为样本，直接识别car阳性t细胞，并同步分析cd4+、cd8+亚群及其动态变化。研究比较了fitc-cd19、pe-cd19和生物素化-cd19检测试剂，三种方法测得的car-t比例总体一致，其中生物素化-cd19对阳性与阴性细胞的区分更清晰，而直接荧光标记cd19流程更简便，更适合常规检测。
03 为什么定点荧光标记蛋白更有优势？
重组蛋白进行荧光标记后需要保持正确的构象和结合活性，因此，荧光基团偶联在哪里、标记过程是否影响蛋白质结构，都会对检测结果产生影响。随机化学标记通常利用蛋白表面的赖氨酸、半胱氨酸等反应基团偶联荧光染料，而这些基团会分布在不同位置，会存在批间一致性差、标记效率不稳定、易聚集等问题，造成car检测结果不准确。
定点标记将荧光基团引入预设位置，使标记位置和标记程度可控，避免对关键抗原表位和蛋白整体构象产生干扰，更好的保留重组蛋白的原有结合活性，显著提升检测的灵敏度、特异性和准确性。
04 定点标记蛋白，让car流式检测更简单
从car转导效率评价到细胞产品表征，再到输注后car-t细胞扩增和持续性监测，流式细胞检测直接读取car抗原结合能力。将重组抗原的构象质量与可控的定点荧光标记结合，进一步减少检测试剂本身带来的变量，为car细胞的稳定、可重复分析提供基础。
基于car-t、car-nk等工程化免疫细胞的检测需求，义翘神州建立定点标记平台，在目标蛋白的特定位置进行荧光偶联，目前可提供pe、apc、af 488、af 647等多种荧光形式，覆盖cd19、bcma、her2、egfr、b7-h3、folr1、slamf7等多个细胞治疗相关靶点。
【参考文献】
1. jianhua ling, wei wang and sa a. wang. flow cytometry-based monitoring of chimeric antigen receptor (car) t cells: reagent selection, assay design, and clinical utility. cytometry. 2026. doi: 10.1002/cyto.b.70026
2. fröse et al., development of an antigen-based approach to noninvasively image car t cells in real time and as a predictive tool. sci. adv. 2024.
3. schanda, et al. sensitivity and specificity of cd19.car-t cell detection by flow cytometry and pcr. cells 2021, https://doi.org/10.3390/cells10113208

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