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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量熔解温度
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山寨马克思

铜虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量熔解温度

第一次做荧光定量，目的基因程序退火温度54度，结果曲线很好，CT值在22-23左右，做了NTC阴性对照，没有荧光信号，熔解曲线单峰，峰值最低900，多数集中在1100-1300左右，但是熔解曲线的退火温度低于80度，只有77度左右，请问各位大侠这是什么原因造成的呢？这样的话，结果还可靠吗？除了重新设计引物外，还有别的调整方式吗？谢谢各位啊~
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。。。。。。。。
1楼 2012-09-22 10:04:55
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回帖置顶 ( 共有1个 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 呵呵 2012-09-24 10:17:13
嗯...................
       个人觉得你把概念搞错了，PCR的时候退火是指引物和模板结合的适合温度，而溶曲中是做的是指模板半数形成单链的温度，基于SYBR的可逆结合特性，所以才可以看溶解曲线中，随着温度升高，模板变性，一半模板成单链时候，此时荧光量的程度。所以那个不叫退火。而且我觉的只要看是否单峰就行了，没有必要觉得温度过低过高吧。你把跑完的东西跑电泳，确定不要低到都是引物二聚体就可以了。
       根据你的描述，这样的结果已经很好了，但是友情提示一下，qPCR里设计引物还是保证高Tm值吧，一般60度以上为宜的。
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Let God do with it as He wills
2楼2012-09-22 12:00:05
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普通回帖

494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-24 10:17:23
溶解曲线的目的是根据峰的数量来判断是否有非特异性扩增。建议你花二十分钟来看一看荧光定量PCR的原理。否则在后面的数据处理过程可能也会出问题。
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3楼2012-09-22 12:31:57
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-24 10:17:38
你看的那个溶解曲线，要是一个单峰的呢，就说明你的引物很好，没有非特异的扩增，说明产物较为单一
54度的退火温度是和你的PCR扩增反应有关，就是你的引物决定了你的这个PCR体系的退火温度
我第一次做新引物的时候，会把REALTIME的产物跑个电泳，看下产物大小是不是我设计的大小。。。
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4楼2012-09-22 20:55:12
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PROBE根本就不需要看溶解曲线，SBR才需要，单一的就OK了，且捆结果很好。
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5楼2012-09-23 09:03:00
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山寨马克思

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-22 12:00:05
嗯...................
       个人觉得你把概念搞错了，PCR的时候退火是指引物和模板结合的适合温度，而溶曲中是做的是指模板半数形成单链的温度，基于SYBR的可逆结合特性，所以才可以看溶解曲线中，随着温度升高 ...

嗯，谢谢指教啊。。。。但是把产物拿来跑电泳看看是不是引物二聚体？这个我做了阴性对照的，结果没有荧光信号啊，这不就是说明了没有引物二聚体吗？
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。。。。。。。。
6楼2012-09-24 18:00:33
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山寨马克思

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 494750284 at 2012-09-22 12:31:57
溶解曲线的目的是根据峰的数量来判断是否有非特异性扩增。建议你花二十分钟来看一看荧光定量PCR的原理。否则在后面的数据处理过程可能也会出问题。

嗯，好的 谢谢指教。
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。。。。。。。。
7楼2012-09-24 18:00:47
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山寨马克思

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-09-22 20:55:12
你看的那个溶解曲线，要是一个单峰的呢，就说明你的引物很好，没有非特异的扩增，说明产物较为单一
54度的退火温度是和你的PCR扩增反应有关，就是你的引物决定了你的这个PCR体系的退火温度
我第一次做新引物的时候 ...

嗯 在跑荧光定量之前都做了检测的，用荧光定量的条件跟体系跑了普通PCR检测的，结果显示都是我设计的大小。
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。。。。。。。。
8楼2012-09-24 18:01:51
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山寨马克思

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by junminh at 2012-09-23 09:03:00
PROBE根本就不需要看溶解曲线，SBR才需要，单一的就OK了，且捆结果很好。

单一峰就可以了吗？那为什么一般都说熔解曲线的温度要在80-85之间结果才可靠啊？
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。。。。。。。。
9楼2012-09-24 18:03:26
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不可理喻_

金虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 应助指数-1, 不要刷应助指数了 2012-09-25 14:20:41
帮顶下，不是很清楚！
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加油，GOGO！！！
10楼2012-09-24 19:12:44
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