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山寨马克思

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[求助] 荧光定量熔解温度

第一次做荧光定量，目的基因程序退火温度54度，结果曲线很好，CT值在22-23左右，做了NTC阴性对照，没有荧光信号，熔解曲线单峰，峰值最低900，多数集中在1100-1300左右，但是熔解曲线的退火温度低于80度，只有77度左右，请问各位大侠这是什么原因造成的呢？这样的话，结果还可靠吗？除了重新设计引物外，还有别的调整方式吗？谢谢各位啊~

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1楼2012-09-22 10:04:55

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山寨马克思

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 494750284 at 2012-09-22 12:31:57
溶解曲线的目的是根据峰的数量来判断是否有非特异性扩增。建议你花二十分钟来看一看荧光定量PCR的原理。否则在后面的数据处理过程可能也会出问题。

嗯，好的谢谢指教。

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。。。。。。。。

7楼2012-09-24 18:00:47

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查看全部 17 个回答

atlanticwi

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 呵呵 2012-09-24 10:17:13

嗯...................
个人觉得你把概念搞错了，PCR的时候退火是指引物和模板结合的适合温度，而溶曲中是做的是指模板半数形成单链的温度，基于SYBR的可逆结合特性，所以才可以看溶解曲线中，随着温度升高，模板变性，一半模板成单链时候，此时荧光量的程度。所以那个不叫退火。而且我觉的只要看是否单峰就行了，没有必要觉得温度过低过高吧。你把跑完的东西跑电泳，确定不要低到都是引物二聚体就可以了。
根据你的描述，这样的结果已经很好了，但是友情提示一下，qPCR里设计引物还是保证高Tm值吧，一般60度以上为宜的。