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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量熔解温度
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 高手，很久不发言了啊 2012-09-25 14:21:07
描述不能反映所有问题，建议上图
楼主怀疑溶解曲线解链温度过低有可能是引物二聚体吧？可以做个浓度梯度PCR验证一下，不过既然NTC无荧光信号，所以是二聚体的可能性不大。产物Tm值低还能可能是因为你的目的片段较小，不知楼主的目的片段多大呢
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山寨马克思
11楼2012-09-24 22:51:30
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山寨马克思

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-09-24 22:51:30
描述不能反映所有问题，建议上图
楼主怀疑溶解曲线解链温度过低有可能是引物二聚体吧？可以做个浓度梯度PCR验证一下，不过既然NTC无荧光信号，所以是二聚体的可能性不大。产物Tm值低还能可能是因为你的目的片段较小 ...

嗯，我的目的片段85bp算小吗？但是我们师兄跑的60几的片段熔解温度也在80度以上。。。。。。。。这个熔解温度低于80度结果就不可靠吗？
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。。。。。。。。
12楼2012-09-27 21:19:14
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gj1018

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

退火温度也很重要，试着调整一下退火温度。
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13楼2012-09-28 05:56:24
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山寨马克思

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by gj1018 at 2012-09-28 05:56:24
退火温度也很重要，试着调整一下退火温度。

嗯，我用57度跑了一次，退火温度还是跟原来的一样，还是在77度左右。。。。。。是不是只有重新换引物跑了？
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。。。。。。。。
14楼2012-09-28 10:49:56
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-28 14:50:28
引用回帖:
9楼: Originally posted by 山寨马克思 at 2012-09-24 18:03:26
单一峰就可以了吗？那为什么一般都说熔解曲线的温度要在80-85之间结果才可靠啊？...

嗯.................
       暂时没有听过80-85这个说法，你PCR产物片段的ATCG组成还影响模板间退火温度呢，建议用Oligo7查一次你的产物Tm再做判断，实在不行就验证P出来的是不是你的东西就可以了。
       1. 跑电泳（这个你肯定也做了）
       2. 切胶回收克隆测序，这个是文章中通用说明qPCR准确性的办法
       祝实验顺利
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Let God do with it as He wills
15楼2012-09-28 14:11:53
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山寨马克思

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-28 14:11:53
嗯.................
       暂时没有听过80-85这个说法，你PCR产物片段的ATCG组成还影响模板间退火温度呢，建议用Oligo7查一次你的产物Tm再做判断，实在不行就验证P出来的是不是你的东西就可以了。
       1. 跑 ...

嗯。。。谢谢啦。。。。。
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。。。。。。。。
16楼2012-10-03 12:29:27
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beescity

至尊木虫 (著名写手)
我也来学习一下， 这几天正在准备做qP。
楼主可否上图啊？如果不想，我们私下运行。
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17楼2012-10-05 09:28:38
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