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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关RT-PCR中的一些困扰的问题
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celia2012

铜虫 (小有名气)

[求助] 有关RT-PCR中的一些困扰的问题

最近要做RT-PCR实时定量PCR,遇到好多问题需要解决，以前没接触过，不知道怎么下手，有以下问题，需各位同胞们帮忙~
1.实验室用的是荧光染料法，相对简单，但特异性差，之前做了几个，发图大家给鉴定一下，是溶解曲线图
第一张明显特异性不行，第一张是两个引物的溶解曲线，看上去靠谱点，不知道大家是怎么分析的，可能原因是什么？
2.关于扩增效率，同一样品同一引物不同时段做出来的结果有时会相差很大，每次扩增效率是不同的，如何做扩增效率，如何避免扩增效率的影响，具体怎么实施
3.关于标准曲线，做标准曲线很麻烦，具体要克隆建库？
4.关于平行，是否一定要做平行，这样好药品好多啊，药品很贵。做的样多
5.CT值在哪个范围内比较可靠？
问题有点多，其实还遇到好多问题~做生物实验真心麻烦啊，还看不着，摸不透，希望有懂的虫友们帮帮忙~
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1楼 2012-07-31 17:16:18
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youlizujuan

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
celia2012: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-01 09:02:25
小丹木木: 金币+3, 鼓励新虫虫 2012-08-01 14:00:28
小丹木木: 操作失误，应该是鼓励应助的。 2012-08-01 14:01:05
1、第二张溶解曲线没问题。
2、扩增效率在90%-110%之间都没问题，每次有差别是正常的。可上下调整引物浓度。
3、不一定非要克隆建库，用标准品也行。还得看你做相对定量还是绝对定量了。
4、每个样做2-3个平行重复，省不得的。
5、CT值一般控制在24-38吧。
经验之谈。
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2楼2012-07-31 19:46:57
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
celia2012: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-01 09:02:32
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验，积极应助 2012-08-01 14:01:24
1、第一个没有明显的MELT CURVE, 而且每个样品差异很大，特异性很差，
   第二个，楼主两个引物是什么意思，不是一对特异引物吗？ 如果是一对特异引物，出现两个TM，也是不对的即特异性也不够。
2、扩增效率在90%-110%之间都没问题，每次有差别是正常的。这就是为什么要做重复的原因。
3、可以把你的目标片段连到载体上，用质粒来做标准曲线。
4、必须做重复，3个BIOLOGICAL REPLICATION，2个TECHNIQUE REPLICATION。
5、CT值一般控制在24-38吧。
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3楼2012-07-31 22:32:38
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celia2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by youlizujuan at 2012-07-31 19:46:57
1、第二张溶解曲线没问题。
2、扩增效率在90%-110%之间都没问题，每次有差别是正常的。可上下调整引物浓度。
3、不一定非要克隆建库，用标准品也行。还得看你做相对定量还是绝对定量了。
4、每个样做2-3个平行重 ...

请问标准品是有卖的吗，一般买哪种的啊，具体不了解哎
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4楼2012-08-01 09:03:28
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celia2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-31 22:32:38
1、第一个没有明显的MELT CURVE, 而且每个样品差异很大，特异性很差，
   第二个，楼主两个引物是什么意思，不是一对特异引物吗？ 如果是一对特异引物，出现两个TM，也是不对的即特异性也不够。
2、扩增效率在90 ...

第二个是做了两队引物，如果出现第一张图的情况怎么办吧，如何看扩增效率啊，“3个BIOLOGICAL REPLICATION，2个TECHNIQUE REPLICATION具体是什么意思啊”
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5楼2012-08-01 09:04:55
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lixc2009

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-01 14:01:39
1、第二张溶解曲线很好的
2、扩增效率在90%-110%之间都没问题
3、没有用过克隆库啊，一般都用标准曲线的啊
4、每个样至少做2-3个平行重复
5、CT值一般控制在24-38吧，一般都这样的
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广州珈源--肿瘤检测、安博抗体，欢迎您！！
6楼2012-08-01 09:31:18
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youlizujuan

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
celia2012: 金币+1 2012-08-01 16:19:02
引用回帖:
4楼: Originally posted by celia2012 at 2012-08-01 09:03:28
请问标准品是有卖的吗，一般买哪种的啊，具体不了解哎...

你的标准品得问你老板了。
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7楼2012-08-01 09:46:19
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-01 14:01:53
celia2012: 金币+3 2012-08-01 16:19:08
引用回帖:
5楼: Originally posted by celia2012 at 2012-08-01 09:04:55
第二个是做了两队引物，如果出现第一张图的情况怎么办吧，如何看扩增效率啊，“3个BIOLOGICAL REPLICATION，2个TECHNIQUE REPLICATION具体是什么意思啊”...

如果是2对引物的话，你的第二个图的结果是很好的。
如果出现第一个图的结果，无需看扩增效率，换引物需要。
3个生物学重复，例如，你检测某一植物的抗病性（假设为感染病毒拷贝数），你需要从三株这个植物分别取样（或者从同一植株的三个不同叶片或其他器官取样），分别提RNA， RT, QPCR. 最后分析各自CT值。
2个技术重复，即重复一次上述实验（3个生物学重复），避免因为操作不当或者误差带来的影响。
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8楼2012-08-01 10:26:07
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