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celia2012铜虫 (小有名气)
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[求助]
有关RT-PCR中的一些困扰的问题
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最近要做RT-PCR实时定量PCR,遇到好多问题需要解决，以前没接触过，不知道怎么下手，有以下问题，需各位同胞们帮忙~ 1.实验室用的是荧光染料法，相对简单，但特异性差，之前做了几个，发图大家给鉴定一下，是溶解曲线图 第一张明显特异性不行，第一张是两个引物的溶解曲线，看上去靠谱点，不知道大家是怎么分析的，可能原因是什么？ 2.关于扩增效率，同一样品同一引物不同时段做出来的结果有时会相差很大，每次扩增效率是不同的，如何做扩增效率，如何避免扩增效率的影响，具体怎么实施 3.关于标准曲线，做标准曲线很麻烦，具体要克隆建库？ 4.关于平行，是否一定要做平行，这样好药品好多啊，药品很贵。做的样多 5.CT值在哪个范围内比较可靠？ 问题有点多，其实还遇到好多问题~做生物实验真心麻烦啊，还看不着，摸不透，希望有懂的虫友们帮帮忙~    |
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chenguestc
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【答案】应助回帖
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1、第一个没有明显的MELT CURVE, 而且每个样品差异很大，特异性很差， 第二个，楼主两个引物是什么意思，不是一对特异引物吗？ 如果是一对特异引物，出现两个TM，也是不对的即特异性也不够。 2、扩增效率在90%-110%之间都没问题，每次有差别是正常的。这就是为什么要做重复的原因。 3、可以把你的目标片段连到载体上，用质粒来做标准曲线。 4、必须做重复，3个BIOLOGICAL REPLICATION，2个TECHNIQUE REPLICATION。 5、CT值一般控制在24-38吧。 |
3楼2012-07-31 22:32:38
youlizujuan
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1、第二张溶解曲线没问题。 2、扩增效率在90%-110%之间都没问题，每次有差别是正常的。可上下调整引物浓度。 3、不一定非要克隆建库，用标准品也行。还得看你做相对定量还是绝对定量了。 4、每个样做2-3个平行重复，省不得的。 5、CT值一般控制在24-38吧。 经验之谈。 |
2楼2012-07-31 19:46:57
celia2012
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4楼2012-08-01 09:03:28
celia2012
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5楼2012-08-01 09:04:55
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