| 查看: 2054 | 回复: 7 | |||
celia2012铜虫 (小有名气)
|
[求助]
有关RT-PCR中的一些困扰的问题
|
最近要做RT-PCR实时定量PCR,遇到好多问题需要解决，以前没接触过，不知道怎么下手，有以下问题，需各位同胞们帮忙~ 1.实验室用的是荧光染料法，相对简单，但特异性差，之前做了几个，发图大家给鉴定一下，是溶解曲线图 第一张明显特异性不行，第一张是两个引物的溶解曲线，看上去靠谱点，不知道大家是怎么分析的，可能原因是什么？ 2.关于扩增效率，同一样品同一引物不同时段做出来的结果有时会相差很大，每次扩增效率是不同的，如何做扩增效率，如何避免扩增效率的影响，具体怎么实施 3.关于标准曲线，做标准曲线很麻烦，具体要克隆建库？ 4.关于平行，是否一定要做平行，这样好药品好多啊，药品很贵。做的样多 5.CT值在哪个范围内比较可靠？ 问题有点多，其实还遇到好多问题~做生物实验真心麻烦啊，还看不着，摸不透，希望有懂的虫友们帮帮忙~    |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有61人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 提取RNA与做RT-PCR的问题
已经有26人回复
- 实时荧光RT-PCR实验的相关问题
已经有8人回复
- 一个很是困扰我的问题：硼氢化钠还原的后处理。。。
已经有13人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- [求助]高保真酶扩不出来
已经有15人回复
- RT-PCR相关问题
已经有5人回复
- 关于RT-PCR中反转录酶的问题
已经有3人回复
- 关于细菌RT-PCR的一些问题，希望同行探讨一下
已经有4人回复
- ＲＴ－ＰＣＲ问题求助
已经有18人回复
youlizujuan
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 48.1
- 散金: 35
- 红花: 1
- 帖子: 184
- 在线: 55.9小时
- 虫号: 1352231
- 注册: 2011-07-21
- 性别: MM
- 专业: 生物信息学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
celia2012: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-01 09:02:25
小丹木木: 金币+3, 鼓励新虫虫 2012-08-01 14:00:28
小丹木木: 操作失误，应该是鼓励应助的。 2012-08-01 14:01:05
感谢参与，应助指数 +1
celia2012: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-01 09:02:25
小丹木木: 金币+3, 鼓励新虫虫 2012-08-01 14:00:28
小丹木木: 操作失误，应该是鼓励应助的。 2012-08-01 14:01:05
|
1、第二张溶解曲线没问题。 2、扩增效率在90%-110%之间都没问题，每次有差别是正常的。可上下调整引物浓度。 3、不一定非要克隆建库，用标准品也行。还得看你做相对定量还是绝对定量了。 4、每个样做2-3个平行重复，省不得的。 5、CT值一般控制在24-38吧。 经验之谈。 |
2楼2012-07-31 19:46:57
chenguestc
木虫 (职业作家)
- MolEPI: 7
- 应助: 576 (博士)
- 贵宾: 0.4
- 金币: 4526.9
- 散金: 1639
- 红花: 176
- 帖子: 4708
- 在线: 353.5小时
- 虫号: 1337860
- 注册: 2011-07-05
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
celia2012: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-01 09:02:32
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验，积极应助 2012-08-01 14:01:24
感谢参与，应助指数 +1
celia2012: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-01 09:02:32
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验，积极应助 2012-08-01 14:01:24
|
1、第一个没有明显的MELT CURVE, 而且每个样品差异很大，特异性很差， 第二个，楼主两个引物是什么意思，不是一对特异引物吗？ 如果是一对特异引物，出现两个TM，也是不对的即特异性也不够。 2、扩增效率在90%-110%之间都没问题，每次有差别是正常的。这就是为什么要做重复的原因。 3、可以把你的目标片段连到载体上，用质粒来做标准曲线。 4、必须做重复，3个BIOLOGICAL REPLICATION，2个TECHNIQUE REPLICATION。 5、CT值一般控制在24-38吧。 |
3楼2012-07-31 22:32:38
celia2012
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 236.4
- 散金: 42
- 帖子: 116
- 在线: 54.7小时
- 虫号: 1654655
- 注册: 2012-03-01
- 专业: 景观与区域生态学
4楼2012-08-01 09:03:28
celia2012
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 236.4
- 散金: 42
- 帖子: 116
- 在线: 54.7小时
- 虫号: 1654655
- 注册: 2012-03-01
- 专业: 景观与区域生态学
5楼2012-08-01 09:04:55
lixc2009
金虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 602.6
- 散金: 9
- 帖子: 76
- 在线: 23小时
- 虫号: 1188951
- 注册: 2011-01-13
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
6楼2012-08-01 09:31:18
youlizujuan
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 48.1
- 散金: 35
- 红花: 1
- 帖子: 184
- 在线: 55.9小时
- 虫号: 1352231
- 注册: 2011-07-21
- 性别: MM
- 专业: 生物信息学
7楼2012-08-01 09:46:19
chenguestc
木虫 (职业作家)
- MolEPI: 7
- 应助: 576 (博士)
- 贵宾: 0.4
- 金币: 4526.9
- 散金: 1639
- 红花: 176
- 帖子: 4708
- 在线: 353.5小时
- 虫号: 1337860
- 注册: 2011-07-05
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
8楼2012-08-01 10:26:07
