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jerryzyy

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[求助] 关于荧光定量的问题

我做的是用荧光定量来分析土壤微生物的群落的大小的，我是用sybr green染料的我刚接触荧光定量，有几个不明白的问题还请大家帮帮忙？
1 我如何确定我是应该用相对定量还是绝对定量来做呢，我要用质粒来做标准曲线这个能说明我该用什么定量吗
2管家基因，目的基因和参比基因都是用来干什么的，能具体讲一下吗？
3什么情况下需要做标准曲线，还是都需要做
4 我是提的土壤DNA，我需要用常规的PCR先摸一下条件再做荧光定量吗、各种不懂啊
5我现在对荧光定量PCR的了解只是一段段的感觉连不起来，不能系统的知道，整个具体步骤应该怎么做，请大家帮帮忙啊，查的文献对于我这个初学者有点看不懂。

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1楼 2012-10-03 10:43:09

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jerryzyy

金虫 (小有名气)

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对了还有各种对照什么的都要有什么对照，该怎么设置啊

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2楼2012-10-03 10:48:08

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chenguestc

木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

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amisking: 金币+4, 鼓励发帖交流问题。 2012-10-03 19:47:24
jerryzyy: 金币+20, ★★★很有帮助 2012-10-04 09:55:43

1 我如何确定我是应该用相对定量还是绝对定量来做呢，我要用质粒来做标准曲线这个能说明我该用什么定量吗

绝对定量把，用QPCR作相对定量那还不如用普通RTPCR了嘛哈。标准曲线在第三个问题里说。

2管家基因，目的基因和参比基因都是用来干什么的，能具体讲一下吗？

目的基因没有什么好说的，当然就是看你目的基因的表达量了啊。管家基因和参比基因是一回事（就是在不同生物的不同发育阶段其表达量基本一致，可以用来作为参照），是用来标准化你的目的基因的，楼主可以在GOOGLE里搜有一下NORMALISE, QPCR，应该有说明。

3什么情况下需要做标准曲线，还是都需要做

做绝对定量都需要，否则如何确定其绝对量呢，用质粒稀释成不同倍数作为模板，用你设计的特异引物来做即可。此外，你可以下载一个STEPONE SOFTWARE，里面有一些帮助说明，你可以仔细阅读一下。

4 我是提的土壤DNA，我需要用常规的PCR先摸一下条件再做荧光定量吗、各种不懂啊

是的，在做QPCR之前，是要用普通PCR摸索一下引物条件，一般是指大体退火温度。因为QPCR和普通PCR的BUFFER并不一致，因此，普通PCR结果只是给QPCR提供一个退火温度的参考。普通PCR退火温度摸索好后（例如60度为最适温度），做QPCR，就在60左右几度来做几个温度，找最好的条件就行了。

5我现在对荧光定量PCR的了解只是一段段的感觉连不起来，不能系统的知道，整个具体步骤应该怎么做，请大家帮帮忙啊，查的文献对于我这个初学者有点看不懂。

多看一点别人的有关QPCR的帖子，在实践中摸索可以，有不懂就随时到小木虫发问即可。

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3楼2012-10-03 12:47:47

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