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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于荧光定量的问题
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jerryzyy

金虫 (小有名气)

[求助] 关于荧光定量的问题

我做的是用荧光定量来分析土壤微生物的群落的大小的，我是用sybr green染料的我刚接触荧光定量，有几个不明白的问题还请大家帮帮忙？
1 我如何确定我是应该用相对定量还是绝对定量来做呢，我要用质粒来做标准曲线这个能说明我该用什么定量吗
2管家基因，目的基因和参比基因都是用来干什么的，能具体讲一下吗？
3什么情况下需要做标准曲线，还是都需要做
4 我是提的土壤DNA，我需要用常规的PCR先摸一下条件再做荧光定量吗、各种不懂啊
5我现在对荧光定量PCR的了解只是一段段的感觉连不起来，不能系统的知道，整个具体步骤应该怎么做，请大家帮帮忙啊，查的文献对于我这个初学者有点看不懂。
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1楼 2012-10-03 10:43:09
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
对了还有各种对照什么的都要有什么对照，该怎么设置啊
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2楼2012-10-03 10:48:08
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖交流问题。 2012-10-03 19:47:24
jerryzyy: 金币+20, ★★★很有帮助 2012-10-04 09:55:43
1 我如何确定我是应该用相对定量还是绝对定量来做呢，我要用质粒来做标准曲线这个能说明我该用什么定量吗
绝对定量把，用QPCR作相对定量那还不如用普通RTPCR了嘛哈。标准曲线在第三个问题里说。

2管家基因，目的基因和参比基因都是用来干什么的，能具体讲一下吗？
目的基因没有什么好说的，当然就是看你目的基因的表达量了啊。管家基因和参比基因是一回事（就是在不同生物的不同发育阶段其表达量基本一致，可以用来作为参照），是用来标准化你的目的基因的，楼主可以在GOOGLE里搜有一下NORMALISE, QPCR，应该有说明。

3什么情况下需要做标准曲线，还是都需要做
做绝对定量都需要，否则如何确定其绝对量呢，用质粒稀释成不同倍数作为模板，用你设计的特异引物来做即可。此外，你可以下载一个STEPONE SOFTWARE，里面有一些帮助说明，你可以仔细阅读一下。

4 我是提的土壤DNA，我需要用常规的PCR先摸一下条件再做荧光定量吗、各种不懂啊
是的，在做QPCR之前，是要用普通PCR摸索一下引物条件，一般是指大体退火温度。因为QPCR和普通PCR的BUFFER并不一致，因此，普通PCR结果只是给QPCR提供一个退火温度的参考。普通PCR退火温度摸索好后（例如60度为最适温度），做QPCR，就在60左右几度来做几个温度，找最好的条件就行了。

5我现在对荧光定量PCR的了解只是一段段的感觉连不起来，不能系统的知道，整个具体步骤应该怎么做，请大家帮帮忙啊，查的文献对于我这个初学者有点看不懂。
多看一点别人的有关QPCR的帖子，在实践中摸索可以，有不懂就随时到小木虫发问即可。
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3楼2012-10-03 12:47:47
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-10-03 12:47:47
1 我如何确定我是应该用相对定量还是绝对定量来做呢，我要用质粒来做标准曲线这个能说明我该用什么定量吗
绝对定量把，用QPCR作相对定量那还不如用普通RTPCR了嘛哈。标准曲线在第三个问题里说。

2管 ...

非常感谢你的解答啊，明白了不少东西，还有就是，我做荧光定量需要设置什么对照啊，对了，金币我应该怎么给你啊，我刚来，不太会玩这个额
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4楼2012-10-03 21:47:39
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

可以设置一个空白对照即可。用灭菌双蒸水（如果你最后稀释CDNA时用的这个的话）做模板，该管PCR最后溶解曲线应该没有PEAK，是断续的，这样就说明你的实验可以排除水污染的问题。这个是阴性对照，如果你有其他阳性对照也可以加上，如果没有也没有关系。
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5楼2012-10-03 23:01:00
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jerryzyy at 2012-10-03 21:47:39
非常感谢你的解答啊，明白了不少东西，还有就是，我做荧光定量需要设置什么对照啊，对了，金币我应该怎么给你啊，我刚来，不太会玩这个额...

要做标准曲线的话，是每次试验都要做标准曲线吗，我如果每个标准品的浓度设两个重复，同时设阴性空白对照，这个阴性对照是要怎么设置啊
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6楼2012-10-04 16:26:59
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-10-03 12:47:47
1 我如何确定我是应该用相对定量还是绝对定量来做呢，我要用质粒来做标准曲线这个能说明我该用什么定量吗
绝对定量把，用QPCR作相对定量那还不如用普通RTPCR了嘛哈。标准曲线在第三个问题里说。

2管 ...

我是做微生物多样性的，不是做某个基因的，是不是就不用设置管家基因对照了啊
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7楼2012-10-04 16:51:39
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

需要做哈，不做内参如何NORMALISE你的结果啊，不NORMALISE结果如何使结果具有可比性呢？？
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8楼2012-10-04 16:59:22
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阿菁

新虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-11-01 12:00:15
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