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关于荧光定量的问题
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我做的是用荧光定量来分析土壤微生物的群落的大小的，我是用sybr green染料的我刚接触荧光定量，有几个不明白的问题还请大家帮帮忙？ 1 我如何确定我是应该用相对定量还是绝对定量来做呢，我要用质粒来做标准曲线这个能说明我该用什么定量吗 2管家基因，目的基因和参比基因都是用来干什么的，能具体讲一下吗？ 3什么情况下需要做标准曲线，还是都需要做 4 我是提的土壤DNA，我需要用常规的PCR先摸一下条件再做荧光定量吗、各种不懂啊 5我现在对荧光定量PCR的了解只是一段段的感觉连不起来，不能系统的知道，整个具体步骤应该怎么做，请大家帮帮忙啊，查的文献对于我这个初学者有点看不懂。 |
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chenguestc
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jerryzyy: 金币+20, ★★★很有帮助 2012-10-04 09:55:43
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1 我如何确定我是应该用相对定量还是绝对定量来做呢，我要用质粒来做标准曲线这个能说明我该用什么定量吗 绝对定量把，用QPCR作相对定量那还不如用普通RTPCR了嘛哈。标准曲线在第三个问题里说。2管家基因，目的基因和参比基因都是用来干什么的，能具体讲一下吗？ 目的基因没有什么好说的，当然就是看你目的基因的表达量了啊。管家基因和参比基因是一回事（就是在不同生物的不同发育阶段其表达量基本一致，可以用来作为参照），是用来标准化你的目的基因的，楼主可以在GOOGLE里搜有一下NORMALISE, QPCR，应该有说明。3什么情况下需要做标准曲线，还是都需要做 做绝对定量都需要，否则如何确定其绝对量呢，用质粒稀释成不同倍数作为模板，用你设计的特异引物来做即可。此外，你可以下载一个STEPONE SOFTWARE，里面有一些帮助说明，你可以仔细阅读一下。4 我是提的土壤DNA，我需要用常规的PCR先摸一下条件再做荧光定量吗、各种不懂啊 是的，在做QPCR之前，是要用普通PCR摸索一下引物条件，一般是指大体退火温度。因为QPCR和普通PCR的BUFFER并不一致，因此，普通PCR结果只是给QPCR提供一个退火温度的参考。普通PCR退火温度摸索好后（例如60度为最适温度），做QPCR，就在60左右几度来做几个温度，找最好的条件就行了。5我现在对荧光定量PCR的了解只是一段段的感觉连不起来，不能系统的知道，整个具体步骤应该怎么做，请大家帮帮忙啊，查的文献对于我这个初学者有点看不懂。 多看一点别人的有关QPCR的帖子，在实践中摸索可以，有不懂就随时到小木虫发问即可。 |
3楼2012-10-03 12:47:47
4楼2012-10-03 21:47:39
