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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量问题
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

[求助] 荧光定量问题

大家好，我现在在做荧光定量PCR，碰到一个问题，请大家指教。
运用简并引物的方法克隆到了某一基因的4个同源基因，同属1个基因家族的。想做荧光定量PCR观察其在不同时期，处理的表达。
现在问题来了，4个都需要做吗？其中两个的同源性特别高，运用primer3在线设计的引物在这两个基因中都可以找到，这样导致做荧光定量PCR时候观测的值应该是两个基因 综合，不能区分这两个基因。

Score = 2235 bits (1210),  Expect = 0.0
Identities = 1638/1838 (89%), Gaps = 56/1838 (3%)
Strand=Plus/Plus

很多不同的地方都是在UTR，我是想通过跨内含子设计引物的，这样就不用怕基因组污染了。一共有7个内含子。

请大家指教。
谢谢！
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1楼 2011-10-03 12:33:14
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

shizishanshang(金币+1): 跨内含子是最好的，但是这两个基因设计出来的引物在两个里面都能找到，不好办啊 2011-10-03 20:27:33
引物肯定得需要跨内含子，要不然分不清了
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2楼2011-10-03 18:10:30
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子

【答案】应助回帖

shizishanshang(金币+3): 谢谢！ 2011-10-04 15:11:23
你好
可能是我没明白你的意思，你说是要看基因表达量的变化 那么你是不是应该只考虑mRNA的序列就够了？至于跨不跨内含子貌似没有什么区别，因为内含子往往在转录的过程中就开始切除，到一个基因被转录出来的时候很可能已经被切除了，那么这段序列貌似就没办法用来设计引物定量了。你说的UTR区域是可以用来设计引物的，鄙人就这样干过，只要这段序列存在于成熟mRNA上，理论上都可以用来设计引物，但需要注意的是不能太靠近mRNA的两端，道理你懂的，容易降解。
我想如果要是我 我会这样做，用扩出来的基因首尾两个外显子（你是用DNA扩出来的片段把）设计引物，在mRNA反转录出来的cDNA中扩增片段，将得到的序列测序，比对4个基因的测序结果，在非保守序列设计定量引物。
希望我的回答对你有帮助。
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可以用QQ找我……
3楼2011-10-04 11:08:09
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 红多多 at 2011-10-04 11:08:09:
你好
可能是我没明白你的意思，你说是要看基因表达量的变化 那么你是不是应该只考虑mRNA的序列就够了？至于跨不跨内含子貌似没有什么区别，因为内含子往往在转录的过程中就开始切除，到一个基因被转录出来的时候 ...

呵呵，我用来做荧光定量的话，设计引物跨内含子主要是怕有DNA的污染，跨内含子的话就很明显得能区分是cDNA扩增还是有基因组DNA的污染的。

不好说这次非得把至少其中一条引物设计到UTR上去，ORF的同源性太高了，其中两个。
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4楼2011-10-04 15:13:55
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子
引用回帖:
4楼: Originally posted by shizishanshang at 2011-10-04 15:13:55:
呵呵，我用来做荧光定量的话，设计引物跨内含子主要是怕有DNA的污染，跨内含子的话就很明显得能区分是cDNA扩增还是有基因组DNA的污染的。

不好说这次非得把至少其中一条引物设计到UTR上去，ORF的同源性太高了 ...

嘿嘿 你可以把提出来的RNA用DNase处理一下呀 这样就没有DNA污染了嘛……
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可以用QQ找我……
5楼2011-10-04 15:19:02
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