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shizishanshang至尊木虫 (职业作家)
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荧光定量问题
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大家好，我现在在做荧光定量PCR，碰到一个问题，请大家指教。 运用简并引物的方法克隆到了某一基因的4个同源基因，同属1个基因家族的。想做荧光定量PCR观察其在不同时期，处理的表达。 现在问题来了，4个都需要做吗？其中两个的同源性特别高，运用primer3在线设计的引物在这两个基因中都可以找到，这样导致做荧光定量PCR时候观测的值应该是两个基因 综合，不能区分这两个基因。 Score = 2235 bits (1210), Expect = 0.0 Identities = 1638/1838 (89%), Gaps = 56/1838 (3%) Strand=Plus/Plus 很多不同的地方都是在UTR，我是想通过跨内含子设计引物的，这样就不用怕基因组污染了。一共有7个内含子。 请大家指教。 谢谢！ |
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2楼2011-10-03 18:10:30
红多多
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【答案】应助回帖
shizishanshang(金币+3): 谢谢！ 2011-10-04 15:11:23
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你好 可能是我没明白你的意思，你说是要看基因表达量的变化 那么你是不是应该只考虑mRNA的序列就够了？至于跨不跨内含子貌似没有什么区别，因为内含子往往在转录的过程中就开始切除，到一个基因被转录出来的时候很可能已经被切除了，那么这段序列貌似就没办法用来设计引物定量了。你说的UTR区域是可以用来设计引物的，鄙人就这样干过，只要这段序列存在于成熟mRNA上，理论上都可以用来设计引物，但需要注意的是不能太靠近mRNA的两端，道理你懂的，容易降解。 我想如果要是我 我会这样做，用扩出来的基因首尾两个外显子（你是用DNA扩出来的片段把）设计引物，在mRNA反转录出来的cDNA中扩增片段，将得到的序列测序，比对4个基因的测序结果，在非保守序列设计定量引物。 希望我的回答对你有帮助。 |
3楼2011-10-04 11:08:09
shizishanshang
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4楼2011-10-04 15:13:55
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5楼2011-10-04 15:19:02