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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于做荧光定量pcr的模板问题
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lianyi1989

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于做荧光定量pcr的模板问题

我是要用荧光定量pcr做昆虫不同时间段的表达量，现在分别提取了不同时间段的rna，是不是要保证反转录的cDNA浓度一致，这样做定量pcr时才比较精确？要保证cDNA的浓度一致的话要怎么做？是不是要根据OD值调整rna的浓度大体一致之后再做反转录？之前没做过荧光定量pcr的，望各位高手指点。
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1楼2010-11-24 13:07:38
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遨游生命

铁杆木虫 (正式写手)
lianyi1989(金币+1): 2011-01-15 16:27:41
我是按照反转录前吧RNA的浓度再微量分光光度计上测定，调整后，以相同的模板浓度做反转录合成cDNA，然后cDNA就以相同浓度进行荧光定量PCR了。反转录后的cDNA 定量没有必要做的。
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7楼2010-11-25 17:40:06
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zuodongyun

铁杆木虫 (正式写手)
lianyi1989(金币+1): 2011-01-15 16:27:27
其实没有必要把CDNA定量，反正都有内参基因比较
我习惯在做逆转录之前测RNA得浓度，用3微克总RNA做逆转录，之后稀释同样的倍数来做模板就可以了
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10楼2010-11-25 19:39:16
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
lianyi1989(金币+1): 2010-11-24 13:21:12
反转录后可以定量CDNA的浓度。
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2楼2010-11-24 13:14:19
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lianyi1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2010-11-24 13:14:19:
反转录后可以定量CDNA的浓度。

怎样定量cDNA的浓度？能不能说详细点，非常感谢~
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3楼2010-11-24 13:21:07
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
就是测DNA浓度啊。没做过？
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4楼2010-11-24 13:25:46
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lianyi1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2010-11-24 13:25:46:
就是测DNA浓度啊。没做过？

没有哎~也是测OD值吗？
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5楼2010-11-25 10:47:52
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phyllislhy

木虫 (正式写手)
首先测OD值定RNA浓度，再跑电泳调整微调
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6楼2010-11-25 11:00:53
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Lee_Py

银虫 (小有名气)
lianyi1989(金币+1): 2011-01-15 16:27:38
如果 你只是做荧光定量的话 cDNA浓度就不需要一致了 如果你做半定量的话 还是调成一致吧
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8楼2010-11-25 18:13:22
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-25 19:32:51
lianyi1989(金币+1): 2011-01-15 16:27:30
我是习惯，同样总量的RNA同一批逆转录成cDNA，同样方法稀释后加同样多去做qPCR

如果cDNA马上做，还是可以不定量的，但如果放了一段时间，最好还是定一下，有些仪器比如nanodrop是能测ssDNA的量的
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9楼2010-11-25 19:31:01
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hyw1989960

木虫 (正式写手)
lianyi1989(金币+1): 2010-11-26 22:09:06
没有必要把CDNA定量
荧光定量是根据目标基因扩增量和内参基因量的比值计算的，CDNA模板浓度高了，同样内参基因也高，比值没什么变化
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11楼2010-11-26 14:54:11
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wbing498352

金虫 (初入文坛)
相同的模板浓度做反转录合成cDNA,
cDNA浓度就不需要一致
使用2 -△△CT法分析数据
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12楼2010-11-29 21:14:41
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杜越欧

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
那用一次实验同一模板的加看家基因和加目的基因两个反应液中的模板浓度不一样可以么
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13楼2012-03-28 09:26:11
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