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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » 荧光定量PCR扩增效率怎么做？？？？我要被逼疯了
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梁小云632

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR扩增效率怎么做？？？？我要被逼疯了

请问各位大侠：
我最近在做4个基因，7个模板的荧光定量PCR，是相对定量，模板间Actin的CT值相差比较大，最低的19最高的26，这样的实验结果能不能用？？？
我用的CDNA没有稀释，稀释过10倍的，actin的CT值在25以上，很高，有什么办法能都解决这个问题？
还有，我怎么确定我的扩增效率，具体应该怎么做？是以一个模板的cDNA做5个数量级的梯度稀释以后，跑一下荧光定量PCR，然后用稀释倍数和CT值做曲线，按公式计算吗？？还有应该用别的方法做啊？？？？？？
谢谢啊？
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1楼 2012-03-02 15:19:44
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tuobaohua

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【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 梁小云632 at 2012-03-02 15:44:12:
非常感谢啊！但是恕我愚昧，我还是不能将此联系到我现在的问题上，我想说，我怎么能求出这个E值，我需要做什么样的实验，还有，我上面描述的稀释倍数+CT值做曲线的方法行得通不？

我也是查的资料，我再去查查，查到了的话就黏贴上来
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4楼2012-03-02 16:54:56
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liveinearth

新虫 (小有名气)
我也在做相对定量，确定处理前后基因表达的改变。我选的是GAPDH和目的基因检测，ddCT法。
但做之前我需要做GAPDH和目的基因的扩增效率是否一样，即需要稀释样品，先做这两个基因的标准曲线。
我想问高手：做这样的标准曲线，在ABI仪器里选按钮时是按AQ还是RQ stand curve？？
谢谢大家。我是新手，问题比较低级的说。
昨天做了选的是RQ stand curve，仪器并没有标准曲线出来，难道要自己画？谁做过能具体说说操作过程吗
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10楼2012-04-26 10:06:27
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tuobaohua

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wenjing120(金币+1): 积极应助！ 2012-03-02 19:37:26
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
         Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n   
         0≤E≤1            
          其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。
         等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.
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2楼2012-03-02 15:31:18
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梁小云632

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by tuobaohua at 2012-03-02 15:31:18:
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
         Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n   
         0≤E≤1            
          其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物 ...

非常感谢啊！但是恕我愚昧，我还是不能将此联系到我现在的问题上，我想说，我怎么能求出这个E值，我需要做什么样的实验，还有，我上面描述的稀释倍数+CT值做曲线的方法行得通不？
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3楼2012-03-02 15:44:12
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tuobaohua

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★
梁小云632(金币+1): 2012-03-05 15:07:05
http://www.dxy.cn/bbs/thread/6575244#6575244

http://wenku.baidu.com/view/351fcd1fa76e58fafab003ed.html
看看这些可不可以解决你的问题
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5楼2012-03-02 16:57:02
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梁小云632

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by tuobaohua at 2012-03-02 16:54:56:
我也是查的资料，我再去查查，查到了的话就黏贴上来

版主好人啊，谢谢你啊，感激不尽啊
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6楼2012-03-05 14:55:53
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tuobaohua

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【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 梁小云632 at 2012-03-05 14:55:53:
版主好人啊，谢谢你啊，感激不尽啊

什么好人啊
RT-PCR对我只是个传说，一度准备做的，后来又一度搁浅了
所以啥都不知道，只是帮忙在网上东看看西找找的弄了点资料而已
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7楼2012-03-05 14:58:39
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梁小云632

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by tuobaohua at 2012-03-05 14:58:39:
什么好人啊
RT-PCR对我只是个传说，一度准备做的，后来又一度搁浅了
所以啥都不知道，只是帮忙在网上东看看西找找的弄了点资料而已

这个确实能把人折磨疯了!
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8楼2012-03-05 15:09:07
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mizhoulong

木虫 (著名写手)

环境卫生、微生物学
这个纯支持和学习。

只要做定量，设备的软件中这些数据都是自动生成，也就一直没有认真学习过。
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环境卫生、微生物学、卫生应急
9楼2012-04-16 10:21:56
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