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梁小云632

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR扩增效率怎么做????我要被逼疯了

请问各位大侠:
我最近在做4个基因,7个模板的荧光定量PCR,是相对定量,模板间Actin的CT值相差比较大,最低的19最高的26,这样的实验结果能不能用???
我用的CDNA没有稀释,稀释过10倍的,actin的CT值在25以上,很高,有什么办法能都解决这个问题?
还有,我怎么确定我的扩增效率,具体应该怎么做?是以一个模板的cDNA做5个数量级的梯度稀释以后,跑一下荧光定量PCR,然后用稀释倍数和CT值做曲线,按公式计算吗??还有应该用别的方法做啊??????
谢谢啊?
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梁小云632

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by tuobaohua at 2012-03-02 15:31:18:
PCR扩增为指数扩增,每一扩增周期后产物的量可以下式表达:
         Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n   
         0≤E≤1            
          其中E表示扩增效率,Yn表示在n个周期后PCR产物 ...

非常感谢啊!但是恕我愚昧,我还是不能将此联系到我现在的问题上,我想说,我怎么能求出这个E值,我需要做什么样的实验,还有,我上面描述的稀释倍数+CT值做曲线的方法行得通不?
3楼2012-03-02 15:44:12
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tuobaohua

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感谢参与,应助指数 +1
wenjing120(金币+1): 积极应助! 2012-03-02 19:37:26
PCR扩增为指数扩增,每一扩增周期后产物的量可以下式表达:
         Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n   
         0≤E≤1            
          其中E表示扩增效率,Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量,Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。
         等式仅在限定的扩增周期数(通常为20或30)内成立。超过此周期数,扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率,最终达到平台,不再扩增.
2楼2012-03-02 15:31:18
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tuobaohua

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引用回帖:
3楼: Originally posted by 梁小云632 at 2012-03-02 15:44:12:
非常感谢啊!但是恕我愚昧,我还是不能将此联系到我现在的问题上,我想说,我怎么能求出这个E值,我需要做什么样的实验,还有,我上面描述的稀释倍数+CT值做曲线的方法行得通不?

我也是查的资料,我再去查查,查到了的话就黏贴上来
4楼2012-03-02 16:54:56
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tuobaohua

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梁小云632(金币+1): 2012-03-05 15:07:05
5楼2012-03-02 16:57:02
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