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梁小云632

新虫 (初入文坛)

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[求助] 荧光定量PCR扩增效率怎么做？？？？我要被逼疯了

请问各位大侠：
我最近在做4个基因，7个模板的荧光定量PCR，是相对定量，模板间Actin的CT值相差比较大，最低的19最高的26，这样的实验结果能不能用？？？
我用的CDNA没有稀释，稀释过10倍的，actin的CT值在25以上，很高，有什么办法能都解决这个问题？
还有，我怎么确定我的扩增效率，具体应该怎么做？是以一个模板的cDNA做5个数量级的梯度稀释以后，跑一下荧光定量PCR，然后用稀释倍数和CT值做曲线，按公式计算吗？？还有应该用别的方法做啊？？？？？？
谢谢啊？

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1楼 2012-03-02 15:19:44

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梁小云632

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

楼: Originally posted by tuobaohua at 2012-03-02 15:31:18:
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
      Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n
      0≤E≤1
      其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物 ...

非常感谢啊！但是恕我愚昧，我还是不能将此联系到我现在的问题上，我想说，我怎么能求出这个E值，我需要做什么样的实验，还有，我上面描述的稀释倍数+CT值做曲线的方法行得通不？

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3楼2012-03-02 15:44:12

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tuobaohua

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
wenjing120(金币+1): 积极应助！ 2012-03-02 19:37:26

PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
      Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n
      0≤E≤1
      其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。
      等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.

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2楼2012-03-02 15:31:18

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