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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量sybrgreen染料荧光值大小的问题
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kyoya

金虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量sybrgreen染料荧光值大小的问题

最近在做荧光定量PCR实验，机器是罗氏480，sybrgreen染料是购买的伯乐的，看别人做的扩增曲线荧光信号的值大约在40左右，而自己的荧光信号却在110左右，是染料的原因吗？还有我的扩增曲线不是S型的，该怎么进行优化？谢谢大家了。
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1楼 2012-05-24 09:23:46
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zgb1982

木虫 (正式写手)
不太懂，我怎么觉得挺正常的
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2楼2012-05-24 09:33:34
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-25 18:56:19
你的曲线形式为linear,扩增曲线很正常啊。你要通过阈值设定来考察CT值的大小，光看荧光值的大小没什么实际意义。
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3楼2012-05-24 10:25:08
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 辛苦，又冒泡了哈 2012-05-24 13:50:25
其实你做的很好，如果不放心的话可以查看别人用同样机器扩增出来的曲线是什么样子的。我觉得是没什么问题
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4楼2012-05-24 11:21:58
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-24 20:05:44
你的结果还是可以的，你的荧光信号在110左右主要是因为你的原料多吗，说白了就是染料相对来说有点多， 你的扩增曲线不是S 型是因为你的循环数不够多，扩增还没到平台期，如果你要得到S扩增曲线，增大你的循环数就行了，实验顺利啊
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我努力我奋斗我成功
5楼2012-05-24 16:25:06
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kyoya

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-24 16:25:06:
你的结果还是可以的，你的荧光信号在110左右主要是因为你的原料多吗，说白了就是染料相对来说有点多， 你的扩增曲线不是S 型是因为你的循环数不够多，扩增还没到平台期，如果你要得到S扩增曲线，增大你的循环数就行

是45次循环，已经很高了。而且大部分的Ct值都在28左右，太高了，如何降低呢？
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6楼2012-05-24 16:33:07
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-25 13:46:24
这样啊，你想啊，ct值的定义是3-15个循环荧光信号的标准差的十倍。这样的话就是你的初始模版浓度太小了，你可以增大一下模版浓度试一下。增大了模版浓度循环数就下来了
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我努力我奋斗我成功
7楼2012-05-25 08:01:22
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skuy1223

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-25 18:56:31
不知道楼主有没有用参比荧光，如果用了的话可以尝试扣除参比荧光的值再做分析。
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努力！
8楼2012-05-25 10:18:16
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ssp5178

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: , 鼓励交流 2012-05-25 18:56:47
西瓜: 金币+2, 补上…… 2012-05-25 18:56:56
你的荧光起跳太晚了，一般在15左右比较好，可能是模板中的浓度不高，引物设计问题或者是你的酶效率不好，这些问题都是可能的，你说的S型，是指过了对其增长期后的平台期，这也是因为你的荧光信号起跳时循环数高，还未达到平台期的原因，不过这样数据没问题，你应该不用循环结束的拷贝数吧，祝实验顺利！
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9楼2012-05-25 14:06:13
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