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pidou213

木虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】荧光定量PCRTm值代表啥意思?

荧光定量PCRTm值代表啥意思?为什么要大于85度才最好呢?请高手指导

再就是溶解曲线前面有小小的峰,那是咋回事?不同模板量小峰不一样,浓度最低的,几乎看不清了
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pidou213

木虫 (正式写手)


为什么没有人回复呢?期待高人啊
2楼2010-12-26 20:35:51
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)



dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-27 08:42:50
Tm值和溶解曲线是为了检测PCR反应特异性的,主峰前的一个小峰可能是非特异性扩增,也可能是引物二聚体,可以降低引物浓度试试
3楼2010-12-26 21:45:21
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by xiaoyu1014126 at 2010-12-26 21:45:21:
Tm值和溶解曲线是为了检测PCR反应特异性的,主峰前的一个小峰可能是非特异性扩增,也可能是引物二聚体,可以降低引物浓度试试

Tm值多大才好呢?还是没有限制嗯?
4楼2010-12-26 23:55:13
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wangy0908

金虫 (正式写手)



pidou213(金币+1):谢谢哦 2010-12-28 01:11:06
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-28 09:07:34
只是说在85左右是最好的。最重要的是你检查一下你的pcr产物是不是特异的吧,如果是特异的,以及是你的目的片段,这个值就不是那么重要了的!
5楼2010-12-27 06:56:30
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poog502

木虫 (正式写手)


我的Tm 80左右,单一主峰.
6楼2010-12-27 08:01:37
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-27 06:56:30:
只是说在85左右是最好的。最重要的是你检查一下你的pcr产物是不是特异的吧,如果是特异的,以及是你的目的片段,这个值就不是那么重要了的!

在峰前面有一个很小很小的突起,可以接受吗?结果是被允许的吗、电泳的时候没检测不到非特异性条带
7楼2010-12-28 01:12:26
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wangy0908

金虫 (正式写手)


pidou213(金币+1):基准线是什么?很小很小的凸起难道不就是达到基准线了吗? 2010-12-28 17:48:55
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-12-28 01:12:26:



在峰前面有一个很小很小的突起,可以接受吗?结果是被允许的吗、电泳的时候没检测不到非特异性条带

如果是个别的引物有这种现象是可以的,但是如果全部引物都有的话,就不是很好。理论上是这种单峰没有达到基准线就可以的。所以你说的很小很小的突起,应该是可以接受的!
8楼2010-12-28 06:44:03
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-28 06:44:03:

如果是个别的引物有这种现象是可以的,但是如果全部引物都有的话,就不是很好。理论上是这种单峰没有达到基准线就可以的。所以你说的很小很小的突起,应该是可以接受的!

基准线是指什么?阈值?很小很小的凸起难道不就是达到基准线了吗?
9楼2010-12-28 17:49:16
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wangy0908

金虫 (正式写手)


pidou213(金币+1):谢谢啦,辛苦啊 2010-12-30 18:18:33
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-12-28 17:49:16:



基准线是指什么?阈值?很小很小的凸起难道不就是达到基准线了吗?

在PCR跑完,生成溶解曲线的时候,同样也有一条直线代表基准线的啊。如果突起没有超过那条线,就可以了!Bio-Rad的CFX分析系统肯定有这条线的!看你用的什么分析仪器的!
10楼2010-12-30 12:25:34
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yanliusu

新虫 (小有名气)


溶解曲线只有单一峰值就是你的特异性条带,前面有个小峰值是非特异性的或者引物二聚体。有小峰的结果是不可靠的,因为SYBR染料能够与所有双链DNA结合,发出荧光,所以你可以增加模板浓度、减少引物量、提高退火温度,直到只有一个单峰了,结果就可以用了。
11楼2010-12-30 14:48:00
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-30 12:25:34:

在PCR跑完,生成溶解曲线的时候,同样也有一条直线代表基准线的啊。如果突起没有超过那条线,就可以了!Bio-Rad的CFX分析系统肯定有这条线的!看你用的什么分析仪器的!

我们用的是ABI,貌似没有你说的那条线呢
12楼2010-12-30 18:18:12
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by yanliusu at 2010-12-30 14:48:00:
溶解曲线只有单一峰值就是你的特异性条带,前面有个小峰值是非特异性的或者引物二聚体。有小峰的结果是不可靠的,因为SYBR染料能够与所有双链DNA结合,发出荧光,所以你可以增加模板浓度、减少引物量、提高退火温 ...

问题是所谓的小峰真的很小很小,我等会传张图片让大家看看好了
13楼2010-12-30 18:19:20
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