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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光定量PCRTm值代表啥意思？
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pidou213

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】荧光定量PCRTm值代表啥意思？

荧光定量PCRTm值代表啥意思？为什么要大于85度才最好呢？请高手指导

再就是溶解曲线前面有小小的峰，那是咋回事？不同模板量小峰不一样，浓度最低的，几乎看不清了
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1楼 2010-12-21 00:00:54
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pidou213

木虫 (正式写手)
为什么没有人回复呢？期待高人啊
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2楼2010-12-26 20:35:51
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-27 08:42:50
Tm值和溶解曲线是为了检测PCR反应特异性的，主峰前的一个小峰可能是非特异性扩增，也可能是引物二聚体，可以降低引物浓度试试
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3楼2010-12-26 21:45:21
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xiaoyu1014126 at 2010-12-26 21:45:21:
Tm值和溶解曲线是为了检测PCR反应特异性的，主峰前的一个小峰可能是非特异性扩增，也可能是引物二聚体，可以降低引物浓度试试

Tm值多大才好呢？还是没有限制嗯？
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4楼2010-12-26 23:55:13
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★
pidou213(金币+1):谢谢哦 2010-12-28 01:11:06
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-28 09:07:34
只是说在85左右是最好的。最重要的是你检查一下你的pcr产物是不是特异的吧，如果是特异的，以及是你的目的片段，这个值就不是那么重要了的！
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5楼2010-12-27 06:56:30
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poog502

木虫 (正式写手)
我的Tm 80左右，单一主峰.
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6楼2010-12-27 08:01:37
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-27 06:56:30:
只是说在85左右是最好的。最重要的是你检查一下你的pcr产物是不是特异的吧，如果是特异的，以及是你的目的片段，这个值就不是那么重要了的！

在峰前面有一个很小很小的突起，可以接受吗？结果是被允许的吗、电泳的时候没检测不到非特异性条带
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7楼2010-12-28 01:12:26
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wangy0908

金虫 (正式写手)
pidou213(金币+1):基准线是什么？很小很小的凸起难道不就是达到基准线了吗？ 2010-12-28 17:48:55
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-12-28 01:12:26:



在峰前面有一个很小很小的突起，可以接受吗？结果是被允许的吗、电泳的时候没检测不到非特异性条带

如果是个别的引物有这种现象是可以的，但是如果全部引物都有的话，就不是很好。理论上是这种单峰没有达到基准线就可以的。所以你说的很小很小的突起，应该是可以接受的！
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8楼2010-12-28 06:44:03
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-28 06:44:03:

如果是个别的引物有这种现象是可以的，但是如果全部引物都有的话，就不是很好。理论上是这种单峰没有达到基准线就可以的。所以你说的很小很小的突起，应该是可以接受的！

基准线是指什么？阈值？很小很小的凸起难道不就是达到基准线了吗？
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9楼2010-12-28 17:49:16
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wangy0908

金虫 (正式写手)
pidou213(金币+1):谢谢啦，辛苦啊 2010-12-30 18:18:33
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-12-28 17:49:16:



基准线是指什么？阈值？很小很小的凸起难道不就是达到基准线了吗？

在PCR跑完，生成溶解曲线的时候，同样也有一条直线代表基准线的啊。如果突起没有超过那条线，就可以了！Bio-Rad的CFX分析系统肯定有这条线的！看你用的什么分析仪器的！
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10楼2010-12-30 12:25:34
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yanliusu

新虫 (小有名气)
溶解曲线只有单一峰值就是你的特异性条带，前面有个小峰值是非特异性的或者引物二聚体。有小峰的结果是不可靠的，因为SYBR染料能够与所有双链DNA结合，发出荧光，所以你可以增加模板浓度、减少引物量、提高退火温度，直到只有一个单峰了，结果就可以用了。
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11楼2010-12-30 14:48:00
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-30 12:25:34:

在PCR跑完，生成溶解曲线的时候，同样也有一条直线代表基准线的啊。如果突起没有超过那条线，就可以了！Bio-Rad的CFX分析系统肯定有这条线的！看你用的什么分析仪器的！

我们用的是ABI，貌似没有你说的那条线呢
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12楼2010-12-30 18:18:12
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yanliusu at 2010-12-30 14:48:00:
溶解曲线只有单一峰值就是你的特异性条带，前面有个小峰值是非特异性的或者引物二聚体。有小峰的结果是不可靠的，因为SYBR染料能够与所有双链DNA结合，发出荧光，所以你可以增加模板浓度、减少引物量、提高退火温 ...

问题是所谓的小峰真的很小很小，我等会传张图片让大家看看好了
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13楼2010-12-30 18:19:20
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