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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR，是相对定量相关问题请教。
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陈帅印

铁虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR，是相对定量相关问题请教。

我现在正在做荧光定量PCR，是相对定量，用ΔΔCT法，新手，请问：到底两品系的起始RNA量是不是要调成相同
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1楼2012-05-12 18:16:57
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不需要，因为是跟actin的比较，所以不用调成一样
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-12 21:16:51
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
尽量调一样，虽然有actin，但差别太大了也调不好。我们做的是定量，所以要有量的概念哈，每一步都保证确定的用量。
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3楼2012-05-12 23:06:28
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:48:11
关键是要做平行，不是同一个样本pcr，是不同实验，不同批次处理的样本要做初始定量的，做了定量，有意识的统一一下就行，加点水稀释，简单的很，至少三个样本起。

不过貌似很多实验室的平行是一次实验，3个加样孔。。。初始定量也就失去了意义。

相对定量原则上与初始样本之间的差异无关，
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4楼2012-05-13 15:58:52
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leannele

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:48:20
我听我们实验室的人说是，要开始的时候RNA定量，反转录后的cDNA最好也定量。跑完之后内参基因的Ct值相差不能大于一个循环。我现在在做相对定量，RNA浓度是一致了，可能是RNA的质量不一致吧，内参的循环差了快2个Ct值了。RNA调浓度的时候最好不要加水稀释，直接测好浓度后取相应的体积就行了。
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5楼2012-05-14 11:27:20
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