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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » qPCR空白有荧光信号，无法去除
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ispenny

新虫 (初入文坛)

[求助] qPCR空白有荧光信号，无法去除

最近做一种新发现的细菌的16S qPCR实验，用的SYBR  Green I 荧光嵌合法，空白都有扩增，一般空白Ct值在30左右，最好记录是34，但一直达不到35以后，貌似还有引物二聚体情况，目的片段约200bp。已经做过很多次，换过药品和引物，尽量保持实验环境无菌，还是无法避免，同样条件做别的菌的就没问题。请高手指点如何改进，不胜感激！图1中红色为标准品溶解曲线，蓝色绿色为阴性对照溶解曲线，阴性对照Ct值分别为32.9和30.5；图2为另一相同实验的结果，阴性对照Ct值分别为29.7和29.0。

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1楼 2012-11-26 15:59:17
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古屋子

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我最近也做了好几次定量，用的也是SYBR  Green I 荧光嵌合法，阴性对照是用水替代模版，其他成分都加进去，做出来的CT值有33左右，也是从没达到35以上
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2楼2012-11-27 15:26:36
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andywang6137

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得你的实验没有问题，阴性对照的一点小峰应该是最后的引物二聚体，不是污染，不影响结果。还想更完满的话，再提高退火温度或者缩短延伸时间看看。
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3楼2012-11-27 16:07:20
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ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-11-27 15:26:36
我最近也做了好几次定量，用的也是SYBR  Green I 荧光嵌合法，阴性对照是用水替代模版，其他成分都加进去，做出来的CT值有33左右，也是从没达到35以上

我做别的菌种定量是可以满足这个要求的，如果引物设计得好，实验环境干净，是应该达到35以上的
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4楼2012-11-27 18:57:10
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ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by andywang6137 at 2012-11-27 16:07:20
个人觉得你的实验没有问题，阴性对照的一点小峰应该是最后的引物二聚体，不是污染，不影响结果。还想更完满的话，再提高退火温度或者缩短延伸时间看看。

谢谢！Ct值在35以下也可以接受吗？
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5楼2012-11-27 18:57:52
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古屋子

铁虫 (初入文坛)
我也想弄清楚这个问题，空白对照的Ct值在35以下数据有效吗？
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6楼2012-11-28 09:14:03
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ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-11-28 09:14:03
我也想弄清楚这个问题，空白对照的Ct值在35以下数据有效吗？

我也想知道有没有这方面规定，之前都是别人教的，没看到标准，希望知道详情的人指点一下
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7楼2012-11-28 09:26:50
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andywang6137

木虫 (著名写手)
记得不太清楚了，33左右，和目的基因相差至少5个以上循环，应该是可以的
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8楼2012-11-28 15:54:50
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