应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » qPCR空白有荧光信号，无法去除
81/1返回列表
查看: 2867  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

ispenny

新虫 (初入文坛)

[求助] qPCR空白有荧光信号，无法去除

最近做一种新发现的细菌的16S qPCR实验，用的SYBR  Green I 荧光嵌合法，空白都有扩增，一般空白Ct值在30左右，最好记录是34，但一直达不到35以后，貌似还有引物二聚体情况，目的片段约200bp。已经做过很多次，换过药品和引物，尽量保持实验环境无菌，还是无法避免，同样条件做别的菌的就没问题。请高手指点如何改进，不胜感激！图1中红色为标准品溶解曲线，蓝色绿色为阴性对照溶解曲线，阴性对照Ct值分别为32.9和30.5；图2为另一相同实验的结果，阴性对照Ct值分别为29.7和29.0。

1.JPG



2.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-11-26 15:59:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

古屋子

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我最近也做了好几次定量，用的也是SYBR  Green I 荧光嵌合法，阴性对照是用水替代模版，其他成分都加进去，做出来的CT值有33左右，也是从没达到35以上
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-27 15:26:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andywang6137

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得你的实验没有问题，阴性对照的一点小峰应该是最后的引物二聚体，不是污染，不影响结果。还想更完满的话，再提高退火温度或者缩短延伸时间看看。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-11-27 16:07:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-11-27 15:26:36
我最近也做了好几次定量，用的也是SYBR  Green I 荧光嵌合法，阴性对照是用水替代模版，其他成分都加进去，做出来的CT值有33左右，也是从没达到35以上

我做别的菌种定量是可以满足这个要求的，如果引物设计得好，实验环境干净，是应该达到35以上的
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-27 18:57:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by andywang6137 at 2012-11-27 16:07:20
个人觉得你的实验没有问题，阴性对照的一点小峰应该是最后的引物二聚体，不是污染，不影响结果。还想更完满的话，再提高退火温度或者缩短延伸时间看看。

谢谢！Ct值在35以下也可以接受吗？
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-27 18:57:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

古屋子

铁虫 (初入文坛)
我也想弄清楚这个问题，空白对照的Ct值在35以下数据有效吗？
赞一下 回复此楼
6楼2012-11-28 09:14:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-11-28 09:14:03
我也想弄清楚这个问题，空白对照的Ct值在35以下数据有效吗？

我也想知道有没有这方面规定，之前都是别人教的，没看到标准，希望知道详情的人指点一下
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-28 09:26:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andywang6137

木虫 (著名写手)
记得不太清楚了，33左右，和目的基因相差至少5个以上循环，应该是可以的
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2012-11-28 15:54:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ispenny 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 可靠消息，8月21号(明天)放榜 +9 医学老男孩 2026-08-20 10/500 2026-08-20 10:21 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +20 yaoyewhu2008 2026-08-20 20/1000 2026-08-20 09:41 by 2026年国自然基�
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +55 医学老男孩 2026-08-13 125/6250 2026-08-20 09:02 by 医学老男孩
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭