应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » qPCR空白有荧光信号，无法去除
81/1返回列表
查看: 2554  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

ispenny

新虫 (初入文坛)

[求助] qPCR空白有荧光信号，无法去除

最近做一种新发现的细菌的16S qPCR实验，用的SYBR  Green I 荧光嵌合法，空白都有扩增，一般空白Ct值在30左右，最好记录是34，但一直达不到35以后，貌似还有引物二聚体情况，目的片段约200bp。已经做过很多次，换过药品和引物，尽量保持实验环境无菌，还是无法避免，同样条件做别的菌的就没问题。请高手指点如何改进，不胜感激！图1中红色为标准品溶解曲线，蓝色绿色为阴性对照溶解曲线，阴性对照Ct值分别为32.9和30.5；图2为另一相同实验的结果，阴性对照Ct值分别为29.7和29.0。

1.JPG



2.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-11-26 15:59:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

古屋子

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我最近也做了好几次定量，用的也是SYBR  Green I 荧光嵌合法，阴性对照是用水替代模版，其他成分都加进去，做出来的CT值有33左右，也是从没达到35以上
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-27 15:26:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andywang6137

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得你的实验没有问题，阴性对照的一点小峰应该是最后的引物二聚体，不是污染，不影响结果。还想更完满的话，再提高退火温度或者缩短延伸时间看看。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-11-27 16:07:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-11-27 15:26:36
我最近也做了好几次定量，用的也是SYBR  Green I 荧光嵌合法，阴性对照是用水替代模版，其他成分都加进去，做出来的CT值有33左右，也是从没达到35以上

我做别的菌种定量是可以满足这个要求的，如果引物设计得好，实验环境干净，是应该达到35以上的
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-27 18:57:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by andywang6137 at 2012-11-27 16:07:20
个人觉得你的实验没有问题，阴性对照的一点小峰应该是最后的引物二聚体，不是污染，不影响结果。还想更完满的话，再提高退火温度或者缩短延伸时间看看。

谢谢！Ct值在35以下也可以接受吗？
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-27 18:57:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

古屋子

铁虫 (初入文坛)
我也想弄清楚这个问题，空白对照的Ct值在35以下数据有效吗？
赞一下 回复此楼
6楼2012-11-28 09:14:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ispenny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-11-28 09:14:03
我也想弄清楚这个问题，空白对照的Ct值在35以下数据有效吗？

我也想知道有没有这方面规定，之前都是别人教的，没看到标准，希望知道详情的人指点一下
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-28 09:26:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andywang6137

木虫 (著名写手)
记得不太清楚了，33左右，和目的基因相差至少5个以上循环，应该是可以的
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2012-11-28 15:54:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ispenny 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 288求调剂 +15 于海海海海 2026-03-19 15/750 2026-03-19 22:41 by 学员8dgXkO
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +14 enenenhui 2026-03-13 15/750 2026-03-19 21:53 by allen-yin
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +9 一鸭鸭哟 2026-03-14 11/550 2026-03-19 17:22 by ！本暗一次！
[考研] 321求调剂 +8 何润采123 2026-03-18 10/500 2026-03-19 16:46 by 何润采123
[考研] 271材料工程求调剂 +6 .6lL 2026-03-18 6/300 2026-03-19 15:41 by haoshis
[考研] 324分 085600材料化工求调剂 +3 llllkkkhh 2026-03-18 3/150 2026-03-19 14:22 by houyaoxu
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +3 @taotao 2026-03-19 3/150 2026-03-19 14:07 by peike
[考研] 281求调剂（0805） +9 烟汐忆海 2026-03-16 19/950 2026-03-19 11:42 by laoshidan
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +4 生物工程调剂 2026-03-16 12/600 2026-03-19 11:10 by 生物工程调剂
[考研] 274求调剂 +6 S.H1 2026-03-18 6/300 2026-03-19 09:34 by 花店相见
[考研] 本科郑州大学物理学院，一志愿华科070200学硕，346求调剂 +4 我不是一根葱 2026-03-18 4/200 2026-03-19 09:11 by 浮云166
[考研] 330求调剂 +3 小材化本科 2026-03-18 3/150 2026-03-18 21:55 by 无懈可击111
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +3 生物工程调剂 2026-03-17 7/350 2026-03-18 20:41 by Wangjingyue
[考研] 0854，计算机类招收调剂 +3 胡辣汤放糖 2026-03-15 6/300 2026-03-18 12:09 by 上岸上岸……..
[考研] 0703化学336分求调剂 +6 zbzihdhd 2026-03-15 7/350 2026-03-18 09:53 by zhukairuo
[考研] 268求调剂 +8 一定有学上- 2026-03-14 9/450 2026-03-17 17:47 by laoshidan
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +4 张vvvv 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:15 by ruiyingmiao
[考研] 东南大学364求调剂 +5 JasonYuiui 2026-03-15 5/250 2026-03-16 21:28 by 木瓜膏
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭