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ispenny

新虫 (初入文坛)

[求助] qPCR空白有荧光信号,无法去除

最近做一种新发现的细菌的16S qPCR实验,用的SYBR  Green I 荧光嵌合法,空白都有扩增,一般空白Ct值在30左右,最好记录是34,但一直达不到35以后,貌似还有引物二聚体情况,目的片段约200bp。已经做过很多次,换过药品和引物,尽量保持实验环境无菌,还是无法避免,同样条件做别的菌的就没问题。请高手指点如何改进,不胜感激!图1中红色为标准品溶解曲线,蓝色绿色为阴性对照溶解曲线,阴性对照Ct值分别为32.9和30.5;图2为另一相同实验的结果,阴性对照Ct值分别为29.7和29.0。

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ispenny

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-11-28 09:14:03
我也想弄清楚这个问题,空白对照的Ct值在35以下数据有效吗?

我也想知道有没有这方面规定,之前都是别人教的,没看到标准,希望知道详情的人指点一下
7楼2012-11-28 09:26:50
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古屋子

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我最近也做了好几次定量,用的也是SYBR  Green I 荧光嵌合法,阴性对照是用水替代模版,其他成分都加进去,做出来的CT值有33左右,也是从没达到35以上
2楼2012-11-27 15:26:36
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andywang6137

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
个人觉得你的实验没有问题,阴性对照的一点小峰应该是最后的引物二聚体,不是污染,不影响结果。还想更完满的话,再提高退火温度或者缩短延伸时间看看。
3楼2012-11-27 16:07:20
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ispenny

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-11-27 15:26:36
我最近也做了好几次定量,用的也是SYBR  Green I 荧光嵌合法,阴性对照是用水替代模版,其他成分都加进去,做出来的CT值有33左右,也是从没达到35以上

我做别的菌种定量是可以满足这个要求的,如果引物设计得好,实验环境干净,是应该达到35以上的
4楼2012-11-27 18:57:10
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