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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增DNA序列无条带
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夏财神

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增DNA序列无条带

最近设计了几对引物分别扩增E. coli和P. aeruginosa的两个基因，但一直没有跑出条带，请高手们指点一下。

想要扩增的目的基因分别为1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相应基因后，用MIT的Primer3设计了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物长20 b。

PCR扩增条件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27个循环。电泳之后没有条带。

考虑没有条带的原因可能是：模板、Taq酶、反应条件等，又做了下试验。
1、模板是基因组DNA，直接电泳后发现23 kb有明显条带，那应该模板没问题。
2、Taq酶是Takara的，前几天同学刚用过，按理说也没问题，而且我也重新做了实验，分别用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都没与条带。
3、引物可能设计的有问题，我用原来跑出过条带的16s引物做了对照，如果16s跑出来那肯定就是引物问题，但都没有条带就不好说了。但是这个条件16s也跑不出来了... 无法确诊
4、重新调整退火温度到56°C，同样无条带。

求诸位高手帮忙分析下，PCR失败的原因可能会什么啊？万分感谢！！
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王萌萌1992

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1楼2013-07-19 19:42:27
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回帖置顶 ( 共有1个 )

夏财神

新虫 (小有名气)
夏财神: 回帖置顶 2013-07-22 22:00:10
多谢各位虫友的帮助，现在已经做出了初步结果。现在分享一下经验。

1、发现做不出条带之后，跟同学讨论了下，做了模板DNA的电泳，发现23K有条带，初步排除了DNA模板的问题。
2、根据虫友的意见，Blast了引物的特异性，并重新计算了引物的浓度，发现引物浓度略高，在体系中做了适当调整。
3、找到了Taq酶的说明书，重新校对了酶、缓冲溶液、dNTP、模板的终浓度要求（发现dNTP浓度低了）；同时根据说明书调整了PCR反应条件（变性和退火说明书要求30s即可，延伸时间调整到了1.5min），并根据虫友的意见进行了温度梯度PCR。

主要是做了上述工作，并对反应条件进行了调整。今天的实验结果目的基因条带比较清晰，多谢诸位虫友的帮忙！
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hyc_charles
39楼2013-07-22 21:59:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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夏财神(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:46:28
PCR不出现扩增条带

　　楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下：　　PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2引物的质量与特异性，3.酶的质量，4. Mg2+ 浓度，5.物理原因，6.靶序列变异。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究,最后写出了调整顺序。　
　1.模板：(1)模板中含有杂蛋白质，(2)模板中含有Taq酶抑制剂，(3)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，(4)在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。(5)模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
　　2.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　
　　　3.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。(4)引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。　
　　　4.Mg2+ 浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。或100μL，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
　　　　5.物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。　　
　　6.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
　　一般的调整顺序：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度。再往后，重新提取DNA模板、换酶和改变反应体积。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。     

   过去，我也回答过PCR无产物的问题，但是这次回答按照近日我更新以后的内容回答。

   看来PCR 的问题是多，这是我在两天里第三次回答同类问题。
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7楼2013-07-19 23:17:45
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夏财神

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-19 23:17:45
PCR不出现扩增条带

　　楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下：　　PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2引物的质量与特异性，3.酶的质量，4. Mg2+ 浓度，5.物理原因，6.靶序列变异。寻找原因亦应针对 ...

谢谢，不过这个都太笼统了吧。
我前面给出了具体的条件和后续探索，希望这位高手能仔细看过之后再回答吧。

具体：
1、模板，前面提到是采用Omega的试剂盒提取，并经过电泳确认了，怎么再判断它是否有问题？
2、已经用两种酶做过了
3、引物，这里讲的很有帮助，到时候给引物跑一下PCR。引物使用Primer3设计的，程序是否有问题？其他的引物参数我也提供了...
4、镁离子在Buffer中提供了，没有精确控制。而这里不应该是Mg2+的原因，因为做16s的时候也没扩出来，而之前用同样buffer是可以的
5、准备做温度梯度，但是温度和时间如何设定呢？
6、菌株来自CGSC，通过NCBI查到序列设计的引物

恳请根据具体情况仔细帮忙分析下，谢谢！
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9楼2013-07-20 00:04:09
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kapa1

金虫 (小有名气)

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夏财神(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:45:57
如果之前可以跑出来的16S也跑不出来了 可能是总DNA的问题吧 你可以再试一下其他之前可以做出来的基因 比如COI这种效果好的 要是也没有 我觉得是总DNA的问题
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夏财神
2楼2013-07-19 19:52:38
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夏财神

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by kapa1 at 2013-07-19 19:52:38
如果之前可以跑出来的16S也跑不出来了 可能是总DNA的问题吧 你可以再试一下其他之前可以做出来的基因 比如COI这种效果好的 要是也没有 我觉得是总DNA的问题

我是用Omega的试剂盒提的，基因组直接跑电泳结果还行。我试试原来提出来确定能跑的DNA看看。
谢谢哈！
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3楼2013-07-19 19:59:40
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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是不是忘加什么东西了, 或者水出了问题.
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4楼2013-07-19 20:40:00
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夏财神

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-07-19 20:40:00
是不是忘加什么东西了, 或者水出了问题.

买的生工的DEPC-treated water，用之前用0.22um滤膜又过滤了一遍...
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5楼2013-07-19 21:16:43
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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夏财神(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:46:11
夏财神: 金币+2, ★有帮助 2013-07-20 17:55:47
夏财神: 金币+5, ★★★很有帮助, 菌液PCR，虽然没有用，好建议 2013-07-22 21:45:13
你模板的量是多少？我之前用的菌液直接做PCR ，也能扩出来，你也可以试试，可以避免你在提基因组的过程中的错误。
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夏财神
6楼2013-07-19 22:21:12
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
myprayer: 金币+1, 是该抽时间把重复帖子给归类了 2013-07-22 20:10:13
小木虫的帖子流动量可能太大，1小时可能有的帖子就很难找了，所以重复类型的问题，我只好做重复的问答，当然如果能够深入地继续讨论我更欢迎！
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8楼2013-07-19 23:35:34
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夏财神

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-07-19 22:21:12
你模板的量是多少？我之前用的菌液直接做PCR ，也能扩出来，你也可以试试，可以避免你在提基因组的过程中的错误。

恩，我先试试前面条件，不行就用菌液做PCR，然后确定是不是重提质粒。谢谢：）
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10楼2013-07-20 00:08:34
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