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夏财神

新虫 (小有名气)

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[求助] PCR扩增DNA序列无条带

最近设计了几对引物分别扩增E. coli和P. aeruginosa的两个基因，但一直没有跑出条带，请高手们指点一下。

想要扩增的目的基因分别为1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相应基因后，用MIT的Primer3设计了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物长20 b。

PCR扩增条件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27个循环。电泳之后没有条带。

考虑没有条带的原因可能是：模板、Taq酶、反应条件等，又做了下试验。
1、模板是基因组DNA，直接电泳后发现23 kb有明显条带，那应该模板没问题。
2、Taq酶是Takara的，前几天同学刚用过，按理说也没问题，而且我也重新做了实验，分别用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都没与条带。
3、引物可能设计的有问题，我用原来跑出过条带的16s引物做了对照，如果16s跑出来那肯定就是引物问题，但都没有条带就不好说了。但是这个条件16s也跑不出来了... 无法确诊
4、重新调整退火温度到56°C，同样无条带。

求诸位高手帮忙分析下，PCR失败的原因可能会什么啊？万分感谢！！

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1楼2013-07-19 19:42:27

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夏财神

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引用回帖:

7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-19 23:17:45
PCR不出现扩增条带

　　楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下：　　PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2引物的质量与特异性，3.酶的质量，4. Mg2+ 浓度，5.物理原因，6.靶序列变异。寻找原因亦应针对 ...

谢谢，不过这个都太笼统了吧。
我前面给出了具体的条件和后续探索，希望这位高手能仔细看过之后再回答吧。

具体：
1、模板，前面提到是采用Omega的试剂盒提取，并经过电泳确认了，怎么再判断它是否有问题？
2、已经用两种酶做过了
3、引物，这里讲的很有帮助，到时候给引物跑一下PCR。引物使用Primer3设计的，程序是否有问题？其他的引物参数我也提供了...
4、镁离子在Buffer中提供了，没有精确控制。而这里不应该是Mg2+的原因，因为做16s的时候也没扩出来，而之前用同样buffer是可以的
5、准备做温度梯度，但是温度和时间如何设定呢？
6、菌株来自CGSC，通过NCBI查到序列设计的引物

恳请根据具体情况仔细帮忙分析下，谢谢！