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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增融合基因
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histoday

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增融合基因

新手：一个新的融合基因，想把它的全长扩出来，大约2000多kb,已经试过很多次，都没有结果。想听听大家的意见。比如用什么酶比较好？我用过普通taq酶，La taq酶，platinum，也重新设计过多次引物，但还是不行，想请教一下大家，谢谢！
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1楼 2012-07-07 16:23:43
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beer胖

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
2k 就用普通taq酶就可以
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2楼2012-07-07 17:09:26
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histoday

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-07 17:09:26
2k 就用普通taq酶就可以

用过了，没有扩出来
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3楼2012-07-07 17:40:57
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野草倚南墙

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-11 13:37:36
楼主给的信息很少，包括基因分析，gc含量也没说，没扩出来的图是什么样的也没有，高gc要把退火温度调高一些，如果平均gc在70%以上，建议你变性时间延长，退火温度用68度试一试。还可以在预变性结束后再加酶，确保酶不会应为长时间高温而变性。
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4楼2012-07-07 22:04:11
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kwkw

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用TOUVHDOWN ，退火从65度到54度，延伸时间2.5分钟
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再苦：也别忘记坚持！再烦：也别忘记微笑！再急：也要注意语气！再累：也要爱自己！低调做人，你会一次比一次稳健。高调做事，你会一次比一次优秀！
5楼2012-07-08 10:37:03
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histoday

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 野草倚南墙 at 2012-07-07 22:04:11
楼主给的信息很少，包括基因分析，gc含量也没说，没扩出来的图是什么样的也没有，高gc要把退火温度调高一些，如果平均gc在70%以上，建议你变性时间延长，退火温度用68度试一试。还可以在预变性结束后再加酶，确保酶 ...

GC含量不高，电泳直接没条带，我用地梯度PCR，设了五个退火温度，我怀疑是不是里面有什么复杂结构
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6楼2012-07-08 12:43:27
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histoday

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kwkw at 2012-07-08 10:37:03
用TOUVHDOWN ，退火从65度到54度，延伸时间2.5分钟

因为我的模板量不多，我先配50ul体系，然后平均分成10ul体系跑PCR，不知道这样有没有影响？？
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7楼2012-07-08 16:01:48
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加大循环数
先上40.
P出来后，再优化条件
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8楼2012-07-09 00:59:09
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 很热心的虫虫哦 2012-07-11 13:38:00
有几个可能的原因：
1.酶的问题，采用延伸能力比较强的酶
2.引物问题，看看引物之间以及本身的配对碱基情况
3.模板问题，GC含量高或者产生内部形成复杂的二级结构，考虑使用GC buffer以及扩增体系中加入甘油等物质
4.退火温度过低或者循环数偏少，提高退火温度以及加大循环数
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9楼2012-07-09 08:41:20
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longrna

新虫 (正式写手)
2000多kb怎么扩啊？
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伟大航线....
10楼2012-07-09 08:44:46
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