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histoday

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增融合基因

新手:一个新的融合基因,想把它的全长扩出来,大约2000多kb,已经试过很多次,都没有结果。想听听大家的意见。比如用什么酶比较好?我用过普通taq酶,La taq酶,platinum,也重新设计过多次引物,但还是不行,想请教一下大家,谢谢!
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beer胖

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2k 就用普通taq酶就可以
2楼2012-07-07 17:09:26
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histoday

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-07 17:09:26
2k 就用普通taq酶就可以

用过了,没有扩出来
3楼2012-07-07 17:40:57
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野草倚南墙

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-11 13:37:36
楼主给的信息很少,包括基因分析,gc含量也没说,没扩出来的图是什么样的也没有,高gc要把退火温度调高一些,如果平均gc在70%以上,建议你变性时间延长,退火温度用68度试一试。还可以在预变性结束后再加酶,确保酶不会应为长时间高温而变性。
4楼2012-07-07 22:04:11
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kwkw

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用TOUVHDOWN ,退火从65度到54度,延伸时间2.5分钟
再苦:也别忘记坚持!再烦:也别忘记微笑!再急:也要注意语气!再累:也要爱自己!低调做人,你会一次比一次稳健。高调做事,你会一次比一次优秀!
5楼2012-07-08 10:37:03
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histoday

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 野草倚南墙 at 2012-07-07 22:04:11
楼主给的信息很少,包括基因分析,gc含量也没说,没扩出来的图是什么样的也没有,高gc要把退火温度调高一些,如果平均gc在70%以上,建议你变性时间延长,退火温度用68度试一试。还可以在预变性结束后再加酶,确保酶 ...

GC含量不高,电泳直接没条带,我用地梯度PCR,设了五个退火温度,我怀疑是不是里面有什么复杂结构
6楼2012-07-08 12:43:27
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histoday

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by kwkw at 2012-07-08 10:37:03
用TOUVHDOWN ,退火从65度到54度,延伸时间2.5分钟

因为我的模板量不多,我先配50ul体系,然后平均分成10ul体系跑PCR,不知道这样有没有影响??
7楼2012-07-08 16:01:48
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
加大循环数
先上40.
P出来后,再优化条件
8楼2012-07-09 00:59:09
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 很热心的虫虫哦 2012-07-11 13:38:00
有几个可能的原因:
1.酶的问题,采用延伸能力比较强的酶
2.引物问题,看看引物之间以及本身的配对碱基情况
3.模板问题,GC含量高或者产生内部形成复杂的二级结构,考虑使用GC buffer以及扩增体系中加入甘油等物质
4.退火温度过低或者循环数偏少,提高退火温度以及加大循环数
9楼2012-07-09 08:41:20
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longrna

新虫 (正式写手)

2000多kb怎么扩啊?
伟大航线....
10楼2012-07-09 08:44:46
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