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histoday

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增融合基因

新手:一个新的融合基因,想把它的全长扩出来,大约2000多kb,已经试过很多次,都没有结果。想听听大家的意见。比如用什么酶比较好?我用过普通taq酶,La taq酶,platinum,也重新设计过多次引物,但还是不行,想请教一下大家,谢谢!
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 很热心的虫虫哦 2012-07-11 13:38:00
有几个可能的原因:
1.酶的问题,采用延伸能力比较强的酶
2.引物问题,看看引物之间以及本身的配对碱基情况
3.模板问题,GC含量高或者产生内部形成复杂的二级结构,考虑使用GC buffer以及扩增体系中加入甘油等物质
4.退火温度过低或者循环数偏少,提高退火温度以及加大循环数
9楼2012-07-09 08:41:20
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beer胖

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2k 就用普通taq酶就可以
2楼2012-07-07 17:09:26
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histoday

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-07 17:09:26
2k 就用普通taq酶就可以

用过了,没有扩出来
3楼2012-07-07 17:40:57
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野草倚南墙

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-11 13:37:36
楼主给的信息很少,包括基因分析,gc含量也没说,没扩出来的图是什么样的也没有,高gc要把退火温度调高一些,如果平均gc在70%以上,建议你变性时间延长,退火温度用68度试一试。还可以在预变性结束后再加酶,确保酶不会应为长时间高温而变性。
4楼2012-07-07 22:04:11
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