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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增融合基因
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新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增融合基因

新手：一个新的融合基因，想把它的全长扩出来，大约2000多kb,已经试过很多次，都没有结果。想听听大家的意见。比如用什么酶比较好？我用过普通taq酶，La taq酶，platinum，也重新设计过多次引物，但还是不行，想请教一下大家，谢谢！
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1楼 2012-07-07 16:23:43
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新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-07 17:09:26
2k 就用普通taq酶就可以

用过了，没有扩出来
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3楼2012-07-07 17:40:57
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4楼: Originally posted by 野草倚南墙 at 2012-07-07 22:04:11
楼主给的信息很少，包括基因分析，gc含量也没说，没扩出来的图是什么样的也没有，高gc要把退火温度调高一些，如果平均gc在70%以上，建议你变性时间延长，退火温度用68度试一试。还可以在预变性结束后再加酶，确保酶 ...

GC含量不高，电泳直接没条带，我用地梯度PCR，设了五个退火温度，我怀疑是不是里面有什么复杂结构
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6楼2012-07-08 12:43:27
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5楼: Originally posted by kwkw at 2012-07-08 10:37:03
用TOUVHDOWN ，退火从65度到54度，延伸时间2.5分钟

因为我的模板量不多，我先配50ul体系，然后平均分成10ul体系跑PCR，不知道这样有没有影响？？
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7楼2012-07-08 16:01:48
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9楼: Originally posted by joan198108 at 2012-07-09 08:41:20
有几个可能的原因：
1.酶的问题，采用延伸能力比较强的酶
2.引物问题，看看引物之间以及本身的配对碱基情况
3.模板问题，GC含量高或者产生内部形成复杂的二级结构，考虑使用GC buffer以及扩增体系中加入甘油等物 ...

您说的延伸能力比较强的酶是什么酶？内部是否形成复杂二级结构我怎么能看出来？
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11楼2012-07-09 10:18:16
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新虫 (初入文坛)
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14楼: Originally posted by 我是小纯洁 at 2012-07-09 16:03:23
建议巢式PCR，楼上说的touchdown，真心没有巢式来的实在。我也是有几个基因移植扩不出来，试过各种温度，各种PCR方法，最后还是巢式PCR管用。基本一次成功。具体方法去网上搜搜吧，原理很简单。

您做巢式时用的什么酶呢？您能不能把您以前做的产物序列和引物发给我呢？我想看看具体两个引物在什么位置。
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16楼2012-07-10 15:43:07
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新虫 (初入文坛)
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18楼: Originally posted by 我是小纯洁 at 2012-07-10 22:29:19
普通taq。具体方法在网上找资料，别老想着伸手要。所谓巢式，就是大括号包着小括号一样。...

做过巢式，没扩出来……
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19楼2012-07-11 19:21:49
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17楼: Originally posted by 380665135 at 2012-07-10 17:19:15
你可以试一下LA taq 加GC buffer 2 ，这个酶对扩增条件不高 能帮助打开二级结构

谢谢，这个酶也用过了……
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20楼2012-07-11 19:22:43
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