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histoday

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by joan198108 at 2012-07-09 08:41:20
有几个可能的原因：
1.酶的问题，采用延伸能力比较强的酶
2.引物问题，看看引物之间以及本身的配对碱基情况
3.模板问题，GC含量高或者产生内部形成复杂的二级结构，考虑使用GC buffer以及扩增体系中加入甘油等物 ...

您说的延伸能力比较强的酶是什么酶？内部是否形成复杂二级结构我怎么能看出来？
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11楼2012-07-09 10:18:16
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kwkw

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by histoday at 2012-07-08 16:01:48
因为我的模板量不多，我先配50ul体系，然后平均分成10ul体系跑PCR，不知道这样有没有影响？？...

理论上没有影响，不过体系这么小，中间来点蒸发就没什么了，为什么不配20ul试一下，另外你用的模板量是不是太少，如果TOUVHDOWN都跑不出来，应该是你的引物跟你的模板不能匹配，可能要重新设计引物。
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再苦：也别忘记坚持！再烦：也别忘记微笑！再急：也要注意语气！再累：也要爱自己！低调做人，你会一次比一次稳健。高调做事，你会一次比一次优秀！
12楼2012-07-09 13:53:46
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by histoday at 2012-07-09 10:18:16
您说的延伸能力比较强的酶是什么酶？内部是否形成复杂二级结构我怎么能看出来？...

延伸能力强的酶的话，就比如TaKaRa的LA Taq延伸能力就优于普通Taq酶。二级结构可以通过软件预测一下，你可以到网上搜搜。
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13楼2012-07-09 14:36:00
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我是小纯洁

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-11 13:38:22
建议巢式PCR，楼上说的touchdown，真心没有巢式来的实在。我也是有几个基因移植扩不出来，试过各种温度，各种PCR方法，最后还是巢式PCR管用。基本一次成功。具体方法去网上搜搜吧，原理很简单。
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14楼2012-07-09 16:03:23
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我是小纯洁

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

http://www.idtdna.com/analyzer/A ... alyzer/Default.aspx，预测二级结构的网站，问问你们同学或者老板怎么用。我在网上给你说不清楚。
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15楼2012-07-09 16:04:47
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histoday

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 我是小纯洁 at 2012-07-09 16:03:23
建议巢式PCR，楼上说的touchdown，真心没有巢式来的实在。我也是有几个基因移植扩不出来，试过各种温度，各种PCR方法，最后还是巢式PCR管用。基本一次成功。具体方法去网上搜搜吧，原理很简单。

您做巢式时用的什么酶呢？您能不能把您以前做的产物序列和引物发给我呢？我想看看具体两个引物在什么位置。
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16楼2012-07-10 15:43:07
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380665135

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你可以试一下LA taq 加GC buffer 2 ，这个酶对扩增条件不高 能帮助打开二级结构
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17楼2012-07-10 17:19:15
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我是小纯洁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by histoday at 2012-07-10 15:43:07
您做巢式时用的什么酶呢？您能不能把您以前做的产物序列和引物发给我呢？我想看看具体两个引物在什么位置。...

普通taq。具体方法在网上找资料，别老想着伸手要。所谓巢式，就是大括号包着小括号一样。
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18楼2012-07-10 22:29:19
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histoday

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 我是小纯洁 at 2012-07-10 22:29:19
普通taq。具体方法在网上找资料，别老想着伸手要。所谓巢式，就是大括号包着小括号一样。...

做过巢式，没扩出来……
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19楼2012-07-11 19:21:49
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histoday

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 380665135 at 2012-07-10 17:19:15
你可以试一下LA taq 加GC buffer 2 ，这个酶对扩增条件不高 能帮助打开二级结构

谢谢，这个酶也用过了……
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20楼2012-07-11 19:22:43
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