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蝈蝈1988木虫 (小有名气)
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[求助]
融合pcr引物设计
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哪位帮忙设计个融合引物啊？我最近设计的效果都很差啊，上下游目的融合片段是400bp左右就行。。。。麻烦各位了。纠结的很，都拖了好几个月了，木有进展啊。呜呜，拜托了。融合pcr的可行度是不是不高啊？ 上游 gaccg 4129921 cagcctcatc aaaattcgtt gaatccaaaa ggctatacat cttccgacgt tcagctctaa 4129981 tatctgccac gggtttctca tgcagacgtt gctttttcac taaatcccat atctgctggc 4130041 gttgctgctc tgttaagctg actccagcga agatacaact atagttatag ttacgttcat 4130101 cattcaggca ataactaacg ttattcttat taccatatgg catacaatat tgagagaagt 4130161 catccgcaat aacattatca gtaccagcag ttccagctaa agcatcggtt gccccaagaa 4130221 caaacattga cgctaaagcc aagattgcta tgttacgcat caaataattc ctcgctttct 4130281 cgaacagtac tattcgatgt cagtgcggat cactataacc ctgctgctgc aaactagcgt 4130341 cagagcatgt aaaagaacgt aaagttatgg aatagcaaag tttgttatcg tattttgctc 4130401 tcggaggaag aaaac 目的基因atgca taaaatctta ttagttgatg atgaccgtga actgacatcg 4130461 ctattaaaag agttgctcga gatggaagga ttcactgttg tgctcgctca tgatggcgaa 4130521 caggcattac aatatatcga ttcttcaatc gatctgctac tactggatat catgatgcca 4130581 cgtaaaaacg gcattgagac actaaaagag ctacgacaag accatcagac tcccgttatt 4130641 atgctaacgg cccgtggaag cgatttagac cgtgttctgg ggttagaact gggtgctgat 4130701 gattatcttc ctaagccgtt caatgatcgt gaactggtgg cccgtatacg tgcgatcctg 4130761 cgccgttcca actggagcga acaacaggct gatagtggga cacctgtact cgaggtcgat 4130821 aaactacagc tcaaccctgg gcggcaggaa gccagctttg acggtacaat tttggatctt 4130881 accggaacag aattcaccct gctttattta ttagcgcaac atttaggaca agtcgtttcc 4130941 cgcgaacact tgagtcagga agtcttggga aaacggttga caccctttga cagagccatt 4131001 gatatgcata tttccaacct gcgccgtaaa ttgccgaacc ggactgacga gttaccttgg 4131061 tttaagacat tacgcggtcg tggatactta atggtctctg caaaatga 下游tc aatagtttga 4131121 cagcccgtat ttttgcgatt ttctggctta cactggcgct cgtcctgatg gtggccttga 4131181 tggcaccaaa actggattca cggcaattga caccgctgtt ggacagtgaa tatcaacagg 4131241 gcatcatact cgcgaaacag atagaaaaag agttaacccg ctaccctgct aatgaactgt 4131301 tttggtggct acgactggat cgcgcaattg caaagtggac gccgccgggg caacttttac 4131361 tgctcgttac cagtgaagga cgtatcgttg atatccagac cagtgaaaag caggttgtcc 4131421 gtaacttcat tggtcaatcc aataatgcag atcatcccaa gaagaagaaa tatggtcgct 4131481 ctgaaatact cgggcccttt tctatccgcg atggtgaaga tcactaccag ctttacctca 4131541 ttaggcccgc aggtagcccc cagtctgact ttattaactt aatgtttgac cgaccccttt 4131601 tattacct |
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 热心积极的虫虫，灰常欢迎来到分子版 2012-06-09 13:40:20
蝈蝈1988: 金币+10, ★有帮助 2012-06-14 16:32:22
蝈蝈1988: 金币+60, ★★★很有帮助, 暂时搞定了。。。。。。。嘿嘿嘿。。。。。。。。。。。乐啊。。。。。。。。。 2012-07-16 09:22:26
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1. PCR上游： UPstream-Forward：ACAAACATTGACGCTAAAGCC UPstream-Reverse：ATACGGGCTGTCAAACTATTGAGTTTTCTTCCTCCGAGAGC UPstream 产物序列（218bp）： ACAAACATTGACGCTAAAGCCAAGATTGCTATGTTACGCATCAAATAATTCCTCGCTTTCTCGAACAGTACTATTCGATGTCAGTGCGGATCACTATAACCCTGCTGCTGCAAACTAGCGTCAGAGCATGTAAAAGAACGTAAAGTTATGGAATAGCAAAGTTTGTTATCGTATTTTGCTCTCGGAGGAAGAAAACTCAATAGTTTGACAGCCCGTAT 2. PCR下游： LOWstream-Forward：GCTCTCGGAGGAAGAAAACTCAATAGTTTGACAGCCCGTAT LOWstream-Reverse：CAAAACAGTTCATTAGCAGGGTA LOWstream 产物序列(215bp) GCTCTCGGAGGAAGAAAACTCAATAGTTTGACAGCCCGTATTTTTGCGATTTTCTGGCTTACACTGGCGCTCGTCCTGATGGTGGCCTTGATGGCACCAAAACTGGATTCACGGCAATTGACACCGCTGTTGGACAGTGAATATCAACAGGGCATCATACTCGCGAAACAGATAGAAAAAGAGTTAACCCGCTACCCTGCTAATGAACTGTTTTG 3. 两个PCR片段分别回收，再合并作为模板，再用： UPstream-Forward: ACAAACATTGACGCTAAAGCC LOWstream-Reverse: CAAAACAGTTCATTAGCAGGGTA 两个引物扩增。即可以得到你要的除去目的基因的上下游片段。 UP+LOW stream产物序列（392 bp）： ACAAACATTGACGCTAAAGCCAAGATTGCTATGTTACGCATCAAATAATTCCTCGCTTTCTCGAACAGTACTATTCGATGTCAGTGCGGATCACTATAACCCTGCTGCTGCAAACTAGCGTCAGAGCATGTAAAAGAACGTAAAGTTATGGAATAGCAAAGTTTGTTATCGTATTTTGCTCTCGGAGGAAGAAAACTCAATAGTTTGACAGCCCGTATTTTTGCGATTTTCTGGCTTACACTGGCGCTCGTCCTGATGGTGGCCTTGATGGCACCAAAACTGGATTCACGGCAATTGACACCGCTGTTGGACAGTGAATATCAACAGGGCATCATACTCGCGAAACAGATAGAAAAAGAGTTAACCCGCTACCCTGCTAATGAACTGTTTTG PCR产物（392bp）连入载体，测序后即可。中间去除了目标基因！ |
9楼2012-06-09 11:00:18
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很热心哦 2012-06-08 14:15:02
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要分3步： 1. PCR上游： UPstream-Forward：GACCGCAGCCTCATCAAAATTCG UPstream-Reverse：ATACGGGCTGTCAAACTATTGAGTTTTCTTCCTCCGAGAGC 2. PCR下游： LOWstream-Forward：GCTCTCGGAGGAAGAAAACTCAATAGTTTGACAGCCCGTAT LOWstream-Reverse：AGGTAATAAAAGGGGTCGGTCAA 3. 两个PCR片段分别回收，再合并作为模板，再用 UPstream-Forward: GACCGCAGCCTCATCAAAATTCG LOWstream-Reverse: AGGTAATAAAAGGGGTCGGTCAA 两个引物扩增。即可以得到你要的除去目的基因的上下游片段。 PCR产物连入载体，测序后即可。 希望有用！ |
5楼2012-06-08 14:00:54
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4楼2012-06-08 11:50:04
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谢啦，再小点的话引物怎么设计啊？？？300-500bp，最有效果的哦，期待啊7楼2012-06-08 15:22:32
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8楼2012-06-08 15:34:42
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