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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR引物设计的问题
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)

[求助] PCR引物设计的问题

我第一次自己设计PCR引物，而且目的基因的5‘端已知，3’端未知，找到了同类基因3‘端的保守序列，保守性比较高，然而我找到的引物与目的基因的结合率一个在82%左右，另一个70%左右（保守序列端引物），不知道能否P出条带？我的目的是要克隆出未知的目的基因然后测序，所以引物两端不需要加酶切位点，只是不知道是否还需要加保护碱基呢？
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脚踏实地追求科学真理！
1楼2011-11-19 09:49:57
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muyanshuang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

雪湛蓝(金币+4): 谢谢！不过我想知道的更细致一些 2011-11-21 19:44:50
silicare(BioEPI+1): 2011-11-24 08:48:02
应该能扩增出目的带，但可能有杂带，把你要的那个大小的带回收。
测序是连接T载体，不需要加酶切位点，需要在做PCR时用taq酶扩增。
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2楼2011-11-21 17:36:41
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muyanshuang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引物只测序不需要加保护碱基了。
不知道你想知道哪方面更细些。其实，主要是做一次PCR，先梯度做，确定退火温度。
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3楼2011-11-21 20:41:47
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by muyanshuang at 2011-11-21 20:41:47:
引物只测序不需要加保护碱基了。
不知道你想知道哪方面更细些。其实，主要是做一次PCR，先梯度做，确定退火温度。

我听我的师姐们说，如果不加保护碱基的话某一端会发生错误链接或引物扩增时发生碱基丢失，我担心这个问题。
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脚踏实地追求科学真理！
4楼2011-11-23 21:28:00
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梁俊平409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

雪湛蓝(金币+4): 谢谢！不过对于我这个基因来说，用race方法扩增基因费用很高！ 2011-11-24 20:12:02
不知道你是怎么设计引物的，既然你有部分序列，为什么还要找同源序列，只需在你的片段上设计3’引物，用race方法即可扩增出3’。
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善待生活
5楼2011-11-23 22:09:30
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 梁俊平409 at 2011-11-23 22:09:30:
不知道你是怎么设计引物的，既然你有部分序列，为什么还要找同源序列，只需在你的片段上设计3’引物，用race方法即可扩增出3’。

我现在只知道这个基因的5‘端的序列，另外一段不知道，而同源序列是根据其他几种菌找的它们的3’端同原序列，猜测可能与我目的基因的3‘序列的相同，所以才这样设计的。用的软件是PrimePrimer5。
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脚踏实地追求科学真理！
6楼2011-11-24 10:11:09
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muyanshuang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

雪湛蓝(金币+2): 对于我们实验室，这个建议很好！谢谢啦！ 2011-11-24 20:12:48
引用回帖:
6楼: Originally posted by 雪湛蓝 at 2011-11-24 10:11:09:
我现在只知道这个基因的5‘端的序列，另外一段不知道，而同源序列是根据其他几种菌找的它们的3’端同原序列，猜测可能与我目的基因的3‘序列的相同，所以才这样设计的。用的软件是PrimePrimer5。

同源性比对设计引物本身就带有一定的预测性，一定的概率可以成功。
可以先设计出来做一下，看看结果。然后决定是否做基因组步移。
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7楼2011-11-24 17:14:19
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muyanshuang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 雪湛蓝 at 2011-11-23 21:28:00:
我听我的师姐们说，如果不加保护碱基的话某一端会发生错误链接或引物扩增时发生碱基丢失，我担心这个问题。

保护碱基一般不影响PCR扩增，可能你师姐们的经验是从你们实验室的实际出发的，也可以加保护碱基，不影响PCR结果。
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8楼2011-11-24 17:16:38
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refreshing11

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 雪湛蓝 at 2011-11-23 21:28:00
我听我的师姐们说，如果不加保护碱基的话某一端会发生错误链接或引物扩增时发生碱基丢失，我担心这个问题。...

保护性碱基是在做酶切的时候需要的，便于酶对酶切位点的识别。
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9楼2013-07-11 17:32:41
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