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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【专题】引入酶切位点的引物设计问题
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

[交流] 【专题】引入酶切位点的引物设计问题

为了跑原核表达设计5‘端加酶切位点的引物
原始引物根据pcr引物设计基本原则设计好了
在加酶切位点的时候烦心了
因为引物要加Not I酶切位点结果引入了8个GC
造成总引物GC含量超过72%，为了配平GC含量于是引进若干TA结果又造成这个引物过长
引物总退火温度升到80多。
我知道引物设计时退火温度是不考虑5’端附加序列的，但是前几个循环之后这些附加是作为引物匹配序列存在的，不能完全无视之吧？
为了防止新的错配出现（前几个循环之后）是否要相应的提高一下退火温度呢？
但是似乎在几个循环之后，带有引物序列的模板已经成为优势模板，似乎退火温度又对它影响不大。。。
真是斩不断理还乱
我是刚刚接触这方面，关于5‘端修饰的pcr引物设计及PCR条件设定，能否请行家指点一二
？
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1楼 2010-09-13 21:44:28
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-09-13 22:47:21:
设计特异性引物的时候不要太在意这些条条框框，大胆设计吧，最后扩增出来了才是最重要的。
用Not I这个酶切位点的确导致GC含量较高，但是它的保护碱基不是也很长吗，而且AT含量很高。这样不就平衡了嘛。
ATAAGA ...

我原来的想法是Ta克隆后酶切 这样还可以方便的测序以验证序列，所以没加保护碱基，配平GC含量真的这么重要么？
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10楼2010-09-14 10:41:22
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figo.339

木虫 (著名写手)
yujiaping1(金币+2): 2010-09-13 21:50:21
你考虑的太多了，加3个合适的嘌呤保护碱基应该就可以。你说的引物过长是多长？应该没问题吧。
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2楼2010-09-13 21:49:13
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by figo.339 at 2010-09-13 21:49:13:
你考虑的太多了，加3个合适的嘌呤保护碱基应该就可以。你说的引物过长是多长？应该没问题吧。

倒是不长30个碱基左右
我想TA克隆之后酶切所以没设计保护碱基
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3楼2010-09-13 21:51:36
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by figo.339 at 2010-09-13 21:49:13:
你考虑的太多了，加3个合适的嘌呤保护碱基应该就可以。你说的引物过长是多长？应该没问题吧。

为什么是嘌呤呢？
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4楼2010-09-13 21:52:10
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figo.339

木虫 (著名写手)
你的GC含量不是高吗，加A或T可以降低一下
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5楼2010-09-13 21:53:22
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figo.339

木虫 (著名写手)
对不起，我说错了，呵呵
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6楼2010-09-13 21:53:42
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figo.339

木虫 (著名写手)
yujiaping1(金币+1): 2010-09-13 22:39:30
30个碱基不算长。我做过加上附加序列共40多个碱基都没问题的。
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7楼2010-09-13 21:54:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
修饰后primer 5引物评定 0 分！
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8楼2010-09-13 22:01:34
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
yujiaping1(金币+2): 2010-09-14 10:39:09
设计特异性引物的时候不要太在意这些条条框框，大胆设计吧，最后扩增出来了才是最重要的。
用Not I这个酶切位点的确导致GC含量较高，但是它的保护碱基不是也很长吗，而且AT含量很高。这样不就平衡了嘛。
ATAAGAAT-GCGGCCGC

[ Last edited by susizheng on 2010-9-13 at 22:51 ]
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Thank-you，so-blue.
9楼2010-09-13 22:47:21
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