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zhange1987

木虫 (小有名气)

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[求助] 关于PCR引物设计及添加酶切位点和保护碱基的问题已有1人参与

大家好我是新手想请教关于引物设计的问题以下是我要扩增的目的基因
1 atggcaaaag atccacgata tgtaggaaat ctaccaaaga taggaatacg cccgacgatc
61 gacggcagaa gaaaaggagt tcgtgaatca ttagaagaaa caacaatgaa catggcaaaa
121 gctgtagcta aattactgga ggaaaatgtt ttttattata atggacagcc agtggaatgt
181 gtgattgcag atacatgtat tggaggagta aaagaagcgg cagaagcagc tgaaaagttt
241 gcaagagaag gcgttggcgt ttcgattact gttactccat gctggtgcta tggaactgaa
301 acaatggata tggatcctca cattccgaaa gcagtttggg gattcaatgg aacagaaaga
361 cctggcgctg tctatttagc tgctgttcta gcaggttata accaaaaagg acttcctgcc
421 tttggaattt acggtaagga tgttcaagat gcaggagata cgaatatacc tgaagatgta
481 aaagagaagc tcattcgttt tgcaaaagca ggactggctg ttgctatgat gaagggtaaa
541 tcttatctct ccattggatc tgtatcaatg ggaattgcag gaagtgttgt gcaagaagac
601 tttttccaaa actatcttgg aatgagaaat gaatatgttg atatgagcga attcgtgcgc
661 agaattgaac tggaaattta cgataaagag gaatatgaaa gagccttaaa atgggtgaag
721 gaaaactgta aagttggtcc ggacaacaat cgcgacggct ttaaaagaac agaagagcag
781 aaggaaaaag attgggaaat cagcgtaaaa atggctctta tcgcacgcga cttaatggtt
841 ggcaataaaa aattagaaga aatgggatat ggagaagaag ctctaggaag aaacgccatt
901 gttgctggtt tccaaggaca gcgtcaatgg accgactatt tcccaaatgg agattttatg
961 gaaacgattt taaattcatc ttttgactgg aacggaaaaa gagcgccata tatttttgca
1021 acggaaaatg ataacttgaa cggcatttcc atgttgttcg gctacctttt aactaatacg
1081 gcgcaaattt ttgccgacgt gagaacttat tggagtccgg aggctgtcaa gcgggtaact
1141 ggctatactc ttgaagggag agcggcaaac ggaatcatcc atttaattaa ttctggagcg
1201 gctgcattgg atggaacagg agaacaaaca aaagacggca aaccagttat taaaccatac
1261 tacgaattga cagatgaaga tattaaaaaa tgcttggaag caacacaatt tagacctgct
1321 tcaactgaat acttcagagg cggcggatat tcaactgact ttttaacaaa aggcggcatg
1381 cctgtaacga tttcgcgctt aaatattgtt aaagggctgg gtcctgttct gcaaattgca
1441 gaaggatata cggttgattt gccggaagaa gttcatgacg tgcttgacaa acggaccgat
1501 ccaacttggc ctaccacttg gtttgttccg aatctaaccg gagaaggtgc atttaaagat
1561 gtttactcgg ttatgaataa ctggggagcc aaccattgtt ccatcagcta tggtcatatt
1621 ggagccgatt taatcacgct ggcatccatt cttcgcattc cggtaaatat gcacaatgta
1681 cctgaggaaa aaatattcag accagatgct tggagcatgt ttggaacaaa agatcttgaa
1741 ggcgctgatt acagagcatg taaaaacttt gggccgatct ataaataa
这是我那个酶基因的CDS序列其上下游序列我找不到
求大家帮忙设计下引物
我后面是要连T载体再转到表达载体PET-28a中进行表达
拜托了非常感谢

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你不会找到路除非你敢于迷路加油。。。

1楼 2011-10-18 16:20:20

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xiaoyuan622

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【答案】应助回帖

★
zhange1987(金币+10): 谢谢哈其实你说的这些我试过了不加酶切位点的引物很好加了就P不成了 2011-10-19 09:07:09
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！对于该贴，如能解决，必要之时将授予专家指数！ 2011-10-19 14:12:45

授人以鱼不如授人以渔。
你用Primer5软件或其它软件，将你的序列粘进去就可以很方便的设计引物了。连T载体不用加酶切位点。连pET-28a时要考虑到你自身序列是否含有酶切位点，如果有，设计引物时就不能用这个酶切位点。对照pET-28a，选择合适的酶切位点，注意两个酶切位点不要靠太近，那样切着不方便。保护碱基的添加则不用考虑太复杂，一般简单的添加GCGC和GGCC就可以了。

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2楼2011-10-19 01:50:49

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zhange1987

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引用回帖:

2楼: Originally posted by xiaoyuan622 at 2011-10-19 01:50:49:
授人以鱼不如授人以渔。
你用Primer5软件或其它软件，将你的序列粘进去就可以很方便的设计引物了。连T载体不用加酶切位点。连pET-28a时要考虑到你自身序列是否含有酶切位点，如果有，设计引物时就不能用这个酶切 ...

其实我是想看看别人设计的和我的有什么区别
我的问题出在哪做个比较呵呵

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你不会找到路除非你敢于迷路加油。。。

3楼2011-10-19 09:10:06

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