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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

[交流] 引物酶切位点问题 已有6人参与

大家好，我要做克隆表达，但是设计的引物没有加酶切位点，做TA克隆的话会不会比较麻烦？有没有比较好的方法改进啊？一般克隆载体大家用什么载体啊？还有表达载体大家又用什么呢？
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思路决定出路。。。
1楼 2013-04-01 14:11:45
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回帖置顶 ( 共有1个 )

dulei

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: MolEPI+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-01 22:33:45
myprayer: 2013-04-01 22:34:37
连接到一般的TA载体就行。你看看后来要用什么酶切位点，找一个带有所需酶切位点的TA载体。
你可用全式金的TA载体。pEASY-T1或pEASY-T3都行，上边有很多酶切位点，看看适合不适合下游操作。
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2楼2013-04-01 15:13:14
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普通回帖

dulei

木虫 (小有名气)
表达载体的话，在大肠杆菌里表达用pET系列的载体。宿主菌用BL21（DE3）。
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3楼2013-04-01 15:14:44
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
加上酶切位点就OK了
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4楼2013-04-01 22:02:29
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Leo_xin

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-04-03 19:31:23
如果你只为了做TA克隆，菌检送测 得到目的序列 而不要后续操作就没必要引入酶切位点，你PCR产物（Taq酶扩 直接有A）跟pMD18-T直接连便可。
如后需要后续实验的 就得加上酶切位点，可以从原来的引物上加，或者重新设计引物，从你的正确质粒上扩，前面加上酶切位点和保护碱基
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还有太多地方值得改进。
5楼2013-04-02 01:11:36
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by dulei at 2013-04-01 15:13:14
连接到一般的TA载体就行。你看看后来要用什么酶切位点，找一个带有所需酶切位点的TA载体。
你可用全式金的TA载体。pEASY-T1或pEASY-T3都行，上边有很多酶切位点，看看适合不适合下游操作。

我同意，和我的想法一样，全式金的T载体还是很给力的，并且还赠送感受态，并不知道现在还赠送不。
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天道酬勤
6楼2013-04-02 01:39:14
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-02 01:11:36
如果你只为了做TA克隆，菌检送测 得到目的序列 而不要后续操作就没必要引入酶切位点，你PCR产物（Taq酶扩 直接有A）跟pMD18-T直接连便可。
如后需要后续实验的 就得加上酶切位点，可以从原来的引物上加，或者重新设 ...

哦，谢谢你哦~
我第一次搞引物设计，拿去合成了，才知道最好加上酶切位点，我是需要做克隆表达的，那么照你这么说，之前没加酶切位点，做表达的时候再设计引物就好了，就是麻烦一些。
而与克隆载体连接时，只要用TAQ酶加A，与T载体能连上就没有问题，是吗？其实我有点担心TAQ酶加A与克隆载体连接会效率低，而且方向可能会错，你觉得有这可能吗？TAQ酶加A的话，与pMD18-T载体连接效率是不是会高？我师姐以前用pGM-T载体，不过我还在考虑用哪种，我的目的片段分别为1600bp和2000bp左右。。。希望多多指教啦！
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思路决定出路。。。
7楼2013-04-02 21:03:18
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dulei at 2013-04-01 15:14:44
表达载体的话，在大肠杆菌里表达用pET系列的载体。宿主菌用BL21（DE3）。

谢谢~
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思路决定出路。。。
8楼2013-04-02 21:06:31
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Leo_xin

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-04-02 21:03:18
哦，谢谢你哦~
我第一次搞引物设计，拿去合成了，才知道最好加上酶切位点，我是需要做克隆表达的，那么照你这么说，之前没加酶切位点，做表达的时候再设计引物就好了，就是麻烦一些。
而与克隆载体连接时，只要用 ...

方向会有  正反向，  但你克隆到载体上，肯定要测序，测序前可以菌检来测试方向，把正方向阳性的送测便可（直接送阳性克隆也是可以的，到时候选取正确的那个克隆就好）  我这边做TA克隆  pMD18连接效率挺高的，不用怕
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还有太多地方值得改进。
9楼2013-04-03 12:47:06
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-03 12:47:06
方向会有  正反向，  但你克隆到载体上，肯定要测序，测序前可以菌检来测试方向，把正方向阳性的送测便可（直接送阳性克隆也是可以的，到时候选取正确的那个克隆就好）  我这边做TA克隆  pMD18连接效率挺高的，不用 ...

谢谢您的指导！
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思路决定出路。。。
10楼2013-04-05 14:21:31
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