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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序结果发现，在引物位置多了一位碱基，是什么原因引起的？
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nestzhao

木虫 (小有名气)

[求助] 测序结果发现，在引物位置多了一位碱基，是什么原因引起的？

今天收到测序结果，发现在我的目标片段的引物的位置，多了一位碱基。不知道是什么原因引起的？？是测序引起的问题，还是引物本身就有问题？？遇到这种情况该怎么处理呢？请各位指教啊！

测序是克隆后去测序的，直接送的是菌液，测序引物用的是通用引物
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给力2011
1楼 2011-12-11 21:24:55
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回帖置顶 ( 共有2个 )

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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nestzhao(金币+3): 2011-12-11 23:12:40
西瓜: 回帖置顶 2011-12-12 17:24:16
西瓜(金币+2): Good！除去引物的问题，PCR本身也有一定的概率会出错，所以克隆时尽量用高保真酶。一般就如panda73所言，多挑几个克隆去测序就好。 2011-12-12 17:29:35
利用PCR进行基因扩增和克隆时，经常出现在引物区的突变，原因主要是引物合成质量不高（缺失或插入），多挑几个阳性克隆进行测序，就好了
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4楼2011-12-11 22:51:14
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中国药人

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 回帖置顶 2011-12-14 16:08:56
西瓜(金币+1): 鼓励反馈！普通Taq酶的错误率有1/1000，做克隆时最好选用高保真酶，如Pfu酶或者混合酶等。 2011-12-14 16:14:06
引用回帖:
10楼: Originally posted by nestzhao at 2011-12-12 22:41:51:
后来怎么处理的啊？重新选克隆送样测序？？

我选了三个克隆啊，测序另外三个都没有问题，只有一个的引物处的酶酶切位点少了一个碱基，而且这个克隆提的质粒双酶切切出的目的片段电泳图比别的克隆大，所以可以肯定是Taq酶有问题。
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有容德乃大，无求品自高。
16楼2011-12-14 00:42:16
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匿名

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nestzhao(金币+1): 2011-12-11 22:26:02
本帖仅楼主可见
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2楼2011-12-11 22:21:57
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by mengfei8336 at 2011-12-11 22:21:57:
不明白你的具体意思，如果多出来的碱基是在目的基因外的，那就无妨。你的目的基因多大？有时DNA过长的话在两端会出现一些错误，是正常的。

我这个多出来的碱基是在片段内的，我觉得这个片段大小应该不是问题，我测序是测了多个反应的，然后再拼接的。这个多出来的碱基位于下游引物的位置的中间。测序是双向测通的。
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给力2011
3楼2011-12-11 22:25:54
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-11 22:51:14:
利用PCR进行基因扩增和克隆时，经常出现在引物区的突变，原因主要是引物合成质量不高（缺失或插入），多挑几个阳性克隆进行测序，就好了

这样的啊。。。那我再去试试
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给力2011
5楼2011-12-11 23:12:34
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lijuanwang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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wanhscn(金币+2): 有道理！ 2011-12-12 00:37:15
nestzhao(金币+2): 2011-12-12 08:44:05
也有可能是测序的问题，对照测序的峰值图，检查一下测序的效果如何。多测几个更好。
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6楼2011-12-11 23:26:26
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nestzhao

木虫 (小有名气)
西瓜: 峰比较锐利，重叠小，效果就是好的。 2011-12-12 17:24:58
引用回帖:
楼: Originally posted by lijuanwang at 2011-12-11 23:26:26:
也有可能是测序的问题，对照测序的峰值图，检查一下测序的效果如何。多测几个更好。

我不知道怎样才叫测序效果好，但我看过他的峰图，每个峰的分离效果还是不错的，没有重叠什么的
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给力2011
7楼2011-12-12 08:45:33
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中国药人

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
nestzhao(金币+1): 2011-12-12 22:41:57
前几天我的克隆也送测序了，挑了四个克隆，有一个在引物处的酶切位点少了一个碱基，其他的测序都正常，这个与taq酶的质量有很大的关系。
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有容德乃大，无求品自高。
8楼2011-12-12 19:05:08
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wx1119

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
nestzhao(金币+1): 2011-12-12 22:42:34
我的测序结果也遇到过，不过没关系的没有影响！
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9楼2011-12-12 19:56:20
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 中国药人 at 2011-12-12 19:05:08:
前几天我的克隆也送测序了，挑了四个克隆，有一个在引物处的酶切位点少了一个碱基，其他的测序都正常，这个与taq酶的质量有很大的关系。

后来怎么处理的啊？重新选克隆送样测序？？
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给力2011
10楼2011-12-12 22:41:51
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