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给力2011

1楼 2011-12-11 21:24:55

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panda73

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nestzhao(金币+3): 2011-12-11 23:12:40
西瓜: 回帖置顶 2011-12-12 17:24:16
西瓜(金币+2): Good！除去引物的问题，PCR本身也有一定的概率会出错，所以克隆时尽量用高保真酶。一般就如panda73所言，多挑几个克隆去测序就好。 2011-12-12 17:29:35

利用PCR进行基因扩增和克隆时，经常出现在引物区的突变，原因主要是引物合成质量不高（缺失或插入），多挑几个阳性克隆进行测序，就好了

4楼2011-12-11 22:51:14

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西瓜: 回帖置顶 2011-12-14 16:08:56
西瓜(金币+1): 鼓励反馈！普通Taq酶的错误率有1/1000，做克隆时最好选用高保真酶，如Pfu酶或者混合酶等。 2011-12-14 16:14:06

引用回帖:

10楼: Originally posted by nestzhao at 2011-12-12 22:41:51:
后来怎么处理的啊？重新选克隆送样测序？？

我选了三个克隆啊，测序另外三个都没有问题，只有一个的引物处的酶酶切位点少了一个碱基，而且这个克隆提的质粒双酶切切出的目的片段电泳图比别的克隆大，所以可以肯定是Taq酶有问题。

有容德乃大，无求品自高。

16楼2011-12-14 00:42:16

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匿名

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nestzhao(金币+1): 2011-12-11 22:26:02

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2楼2011-12-11 22:21:57

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nestzhao

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楼: Originally posted by mengfei8336 at 2011-12-11 22:21:57:
不明白你的具体意思，如果多出来的碱基是在目的基因外的，那就无妨。你的目的基因多大？有时DNA过长的话在两端会出现一些错误，是正常的。

我这个多出来的碱基是在片段内的，我觉得这个片段大小应该不是问题，我测序是测了多个反应的，然后再拼接的。这个多出来的碱基位于下游引物的位置的中间。测序是双向测通的。

给力2011

3楼2011-12-11 22:25:54

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nestzhao

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楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-11 22:51:14:
利用PCR进行基因扩增和克隆时，经常出现在引物区的突变，原因主要是引物合成质量不高（缺失或插入），多挑几个阳性克隆进行测序，就好了

这样的啊。。。那我再去试试

给力2011

5楼2011-12-11 23:12:34

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lijuanwang

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wanhscn(金币+2): 有道理！ 2011-12-12 00:37:15
nestzhao(金币+2): 2011-12-12 08:44:05

也有可能是测序的问题，对照测序的峰值图，检查一下测序的效果如何。多测几个更好。

6楼2011-12-11 23:26:26

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nestzhao

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西瓜: 峰比较锐利，重叠小，效果就是好的。 2011-12-12 17:24:58

引用回帖:

楼: Originally posted by lijuanwang at 2011-12-11 23:26:26:
也有可能是测序的问题，对照测序的峰值图，检查一下测序的效果如何。多测几个更好。

我不知道怎样才叫测序效果好，但我看过他的峰图，每个峰的分离效果还是不错的，没有重叠什么的

给力2011

7楼2011-12-12 08:45:33

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nestzhao(金币+1): 2011-12-12 22:41:57

前几天我的克隆也送测序了，挑了四个克隆，有一个在引物处的酶切位点少了一个碱基，其他的测序都正常，这个与taq酶的质量有很大的关系。

有容德乃大，无求品自高。

8楼2011-12-12 19:05:08

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nestzhao(金币+1): 2011-12-12 22:42:34

我的测序结果也遇到过，不过没关系的没有影响！

9楼2011-12-12 19:56:20

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nestzhao

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楼: Originally posted by 中国药人 at 2011-12-12 19:05:08:
前几天我的克隆也送测序了，挑了四个克隆，有一个在引物处的酶切位点少了一个碱基，其他的测序都正常，这个与taq酶的质量有很大的关系。

后来怎么处理的啊？重新选克隆送样测序？？