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695

木虫 (职业作家)

[交流] 测序关于碱基的确定 已有1人参与

现在我的RACE基本就快确定了,序列也拼接的差不多了,但是现在遇到两个碱基差异的问题,还望有经验的虫友多多指教!

具体问题是,在我的overlapping fragment上,有两个碱基与我的5RACE产物测序不一致,具体表现在1.多出了一个碱基C;2.原有CDS序列上是T,而我的测序显示为C。但是我的3RACE测序与已发表的CDS序列是一致的,这里附上测序结果,望大家相助,看我该如何定夺,还是继续在多加测序,不甚感激!
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gastrodia

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你看看蛋白的序列有没有变,如果蛋白的序列没有变,碱基出现替换是很正常的,此外RACE拼接的结果序列不正确是很正常的,你可以通过RACE的信息设计扩增cDNA的引物,用高保真酶进行PCR,得到cDNA后克隆测序,以此序列为准,文章上都这样
2楼2009-09-24 20:35:43
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annwt

木虫 (正式写手)

测序本身也是PCR反应,
建议多测几回,换个测序方向。
3楼2009-09-24 21:17:51
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
从峰图上可以看出碱基的峰很明显,应该不是测错了或者拼接错了。建议用像如Kod这样的高保真酶重新PCR,测序。
4楼2009-09-26 00:05:14
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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-26 00:05:
从峰图上可以看出碱基的峰很明显,应该不是测错了或者拼接错了。建议用像如Kod这样的高保真酶重新PCR,测序。

也不是了,我就是这两个碱基的差异,我想我是否可以设计两端引物,再做扩增全长测序验证,我当时用的是Advantage 2 PCR polymerase!
5楼2009-09-26 05:12:27
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

好奇:既然已有已发表的CDS为什么还要做RACE?
6楼2009-09-26 08:45:52
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bioxixi

木虫 (著名写手)

峰图很好,建议另取一个克隆测序,并让测序公司注意这两个地方,测准确点儿
一般RACE的酶应该质量也不错了,要不就换质量更好的酶,或者换个测序公司试试
7楼2009-09-26 09:23:19
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vickystt

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果不用做RACE的试剂盒,用哪种酶的效果会好一点?
8楼2011-03-15 15:34:35
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