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maxwell1988

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于PCR产物的突变 已有4人参与

我是个刚进入分子克隆实验的菜鸟。前段时间刚从外周血细胞中提取了其总RNA,再进行RT-PCR逆转录成cDNA。以该cDNA作为模板,进行常规的PCR。之后就是简单的割胶回收,TA克隆。
   送去测序后,连续几次得到的结果都是在目的基因序列的3'端大概9个碱基处,多了一个同样的一个碱基。
   如果是突变,那么为什么会在同样的地方出现同样的情况?如果是模板的问题,为什么以该模板做的其他PCR产物拿去测序却完全正确?会不会是TA克隆出了什么问题?请高手们多多指教!
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won7

金虫 (小有名气)

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silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-06 12:13:01
不太明白,你怎么确定哪个位置是一个突变,而不是真实的碱基呢?尽管PCR因为酶的问题会有错配,但几次PCR、测序都是相同的话,应该可以确定是真实碱基了,但是如果你是用同样的克隆,测序几次,都相同就没有什么问题,说明测序没有问题。

[ Last edited by won7 on 2010-12-6 at 11:17 ]
2楼2010-12-06 11:15:47
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ben1147

木虫 (正式写手)


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靠末端那么近,多个克隆又都一样,是不是引物上的突变啊
3楼2010-12-06 12:22:20
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)

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dhd997(金币+1):热心版版,good 2010-12-06 15:52:11
看一看是不是3短的引物设计本身有没有问题,或者是合成回来的引物有突变?!
千万不要因为走的太久,而忘记了我们为什么出发~~~~~~ForDream~~~~~~
4楼2010-12-06 13:49:28
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maxwell1988

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by won7 at 2010-12-06 11:15:47:
不太明白,你怎么确定哪个位置是一个突变,而不是真实的碱基呢?尽管PCR因为酶的问题会有错配,但几次PCR、测序都是相同的话,应该可以确定是真实碱基了,但是如果你是用同样的克隆,测序几次,都相同就没有什么问 ...

因为测序结果会跟NCBI公布的序列进行比对啊,呵呵,那样就很容易看出来什么地方多了碱基,什么地方少了或是突变了
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5楼2010-12-06 15:25:18
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maxwell1988

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-12-06 12:22:20:
靠末端那么近,多个克隆又都一样,是不是引物上的突变啊

一语惊醒梦中人啊!我重新设计了下游引物,静待结果!谢谢您的提醒!
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6楼2010-12-06 15:26:16
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maxwell1988

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by rainwander at 2010-12-06 13:49:28:
看一看是不是3短的引物设计本身有没有问题,或者是合成回来的引物有突变?!

我猜十有八九就是引物的问题了,测了好几次,都是在引物范围内碱基出了问题!引物公司害人啊,浪费了我一个半月的时间!
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7楼2010-12-06 15:27:40
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)

优秀版主


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引用回帖:
Originally posted by maxwell1988 at 2010-12-06 15:27:40:

我猜十有八九就是引物的问题了,测了好几次,都是在引物范围内碱基出了问题!引物公司害人啊,浪费了我一个半月的时间!

有这种可能,我就遇到过一次,是把引物合成错了一个碱基,老悲剧了。但是这种情况发生的概率比较低的。
千万不要因为走的太久,而忘记了我们为什么出发~~~~~~ForDream~~~~~~
8楼2010-12-06 16:35:15
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