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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于PCR产物的突变
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maxwell1988

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于PCR产物的突变 已有4人参与

我是个刚进入分子克隆实验的菜鸟。前段时间刚从外周血细胞中提取了其总RNA，再进行RT-PCR逆转录成cDNA。以该cDNA作为模板，进行常规的PCR。之后就是简单的割胶回收，TA克隆。
   送去测序后，连续几次得到的结果都是在目的基因序列的3'端大概9个碱基处，多了一个同样的一个碱基。
   如果是突变，那么为什么会在同样的地方出现同样的情况？如果是模板的问题，为什么以该模板做的其他PCR产物拿去测序却完全正确？会不会是TA克隆出了什么问题？请高手们多多指教！
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perfectpig向前冲！别犹豫！
1楼 2010-12-06 10:53:12
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won7

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-06 12:13:01
不太明白，你怎么确定哪个位置是一个突变，而不是真实的碱基呢？尽管PCR因为酶的问题会有错配，但几次PCR、测序都是相同的话，应该可以确定是真实碱基了，但是如果你是用同样的克隆，测序几次，都相同就没有什么问题，说明测序没有问题。

[ Last edited by won7 on 2010-12-6 at 11:17 ]
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2楼2010-12-06 11:15:47
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
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靠末端那么近，多个克隆又都一样，是不是引物上的突变啊
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3楼2010-12-06 12:22:20
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)

优秀版主
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dhd997(金币+1):热心版版，good 2010-12-06 15:52:11
看一看是不是3短的引物设计本身有没有问题，或者是合成回来的引物有突变？!
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千万不要因为走的太久，而忘记了我们为什么出发~~~~~~ForDream~~~~~~
4楼2010-12-06 13:49:28
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maxwell1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by won7 at 2010-12-06 11:15:47:
不太明白，你怎么确定哪个位置是一个突变，而不是真实的碱基呢？尽管PCR因为酶的问题会有错配，但几次PCR、测序都是相同的话，应该可以确定是真实碱基了，但是如果你是用同样的克隆，测序几次，都相同就没有什么问 ...

因为测序结果会跟NCBI公布的序列进行比对啊，呵呵，那样就很容易看出来什么地方多了碱基，什么地方少了或是突变了
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perfectpig向前冲！别犹豫！
5楼2010-12-06 15:25:18
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maxwell1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-12-06 12:22:20:
靠末端那么近，多个克隆又都一样，是不是引物上的突变啊

一语惊醒梦中人啊！我重新设计了下游引物，静待结果！谢谢您的提醒！
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perfectpig向前冲！别犹豫！
6楼2010-12-06 15:26:16
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maxwell1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rainwander at 2010-12-06 13:49:28:
看一看是不是3短的引物设计本身有没有问题，或者是合成回来的引物有突变？!

我猜十有八九就是引物的问题了，测了好几次，都是在引物范围内碱基出了问题！引物公司害人啊，浪费了我一个半月的时间！
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perfectpig向前冲！别犹豫！
7楼2010-12-06 15:27:40
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)

优秀版主
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by maxwell1988 at 2010-12-06 15:27:40:

我猜十有八九就是引物的问题了，测了好几次，都是在引物范围内碱基出了问题！引物公司害人啊，浪费了我一个半月的时间！

有这种可能，我就遇到过一次，是把引物合成错了一个碱基，老悲剧了。但是这种情况发生的概率比较低的。
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千万不要因为走的太久，而忘记了我们为什么出发~~~~~~ForDream~~~~~~
8楼2010-12-06 16:35:15
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