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黑沉

金虫 (正式写手)

[求助] 点突变,自己设计互补的突变引物做PCR,这个PCR产物是怎么鉴定?是线性的还是环状的?已有1人参与

点突变,自己设计互补的突变引物做PCR,这个PCR产物是怎么鉴定?是线性的还是环状的?有人说产物是带缺口的环状,没明白。线性的就是和模板质粒线性化的大小一致,环状的就是和模板质粒大小一致,对吗?
参考试剂盒的说明,此PCR产物不用鉴定,直接用Dpn1酶消化,转化就能长出阳性菌,如若是线性的在大肠杆菌中又怎么长出环状的质粒呢?
初做分子这块,希望各位搭手指教,谢啦!
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流~ 2012-04-01 17:33:45
1.PCR产物应该是环,跟原始模板一样的环,除了突变的位点。
2.DpnI消化的是混在PCR产物中的被甲基化的原始模板,剩下的是突变成功的环状DNA。
生活是面镜子~
2楼2012-03-31 22:57:25
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黑沉

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by to-be at 2012-03-31 22:57:25:
1.PCR产物应该是环,跟原始模板一样的环,除了突变的位点。
2.DpnI消化的是混在PCR产物中的被甲基化的原始模板,剩下的是突变成功的环状DNA。

我PCR产物小量跑了下电泳,质粒线性化大小的片段最亮,所以我怀疑这个PCR产物是不是就是线性化的。
我已经用.DpnI消化后转化了,结果还不知道,先等着,呵呵。
谢谢你哈,我现在就只想弄清楚这个PCR产物到底是环状的还是线性化的,呵呵……
3楼2012-03-31 23:02:36
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to-be

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 黑沉 at 2012-03-31 23:02:36:
我PCR产物小量跑了下电泳,质粒线性化大小的片段最亮,所以我怀疑这个PCR产物是不是就是线性化的。
我已经用.DpnI消化后转化了,结果还不知道,先等着,呵呵。
谢谢你哈,我现在就只想弄清楚这个PCR产物到底是 ...

你怎么跑的电泳?Marker,有质粒对照?怎么就确定是线性化?
生活是面镜子~
4楼2012-03-31 23:19:07
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黑沉

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by to-be at 2012-03-31 23:19:07:
你怎么跑的电泳?Marker,有质粒对照?怎么就确定是线性化?

Marker和质粒对照都一起跑了,质粒线性化大小的条带很亮,质粒大小的条带就暗了很多了,这应该就是扩增出线性化的产物了吧。
5楼2012-04-01 09:53:32
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痞子无敌

金虫 (正式写手)

师兄,看到你这个帖子,我想知道引物要怎样设计才可以有环状产物这样的结果?前后引物是要完全互补还是只需要有几bp的互补?如果互补的话,退火的时候引物不会形成二聚体吗?
当你当你的眼睛眯着笑
6楼2016-11-29 13:51:03
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你的PCR产物是线状的,有缺口的一个片段,但是e.coli会把这个缺口修复。你可以在网上找一下  Stratagene QuikChange,这个的使用说明书,上面有很详细的说明
上班族,学习ing……
7楼2016-12-01 10:59:47
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