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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 点突变，自己设计互补的突变引物做PCR，这个PCR产物是怎么鉴定？是线性的还是环状的？
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黑沉

金虫 (正式写手)

[求助] 点突变，自己设计互补的突变引物做PCR，这个PCR产物是怎么鉴定？是线性的还是环状的？ 已有1人参与

点突变，自己设计互补的突变引物做PCR，这个PCR产物是怎么鉴定？是线性的还是环状的？有人说产物是带缺口的环状，没明白。线性的就是和模板质粒线性化的大小一致，环状的就是和模板质粒大小一致，对吗？
参考试剂盒的说明，此PCR产物不用鉴定，直接用Dpn1酶消化，转化就能长出阳性菌，如若是线性的在大肠杆菌中又怎么长出环状的质粒呢？
初做分子这块，希望各位搭手指教，谢啦！
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1楼 2012-03-31 22:01:02
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流~ 2012-04-01 17:33:45
1.PCR产物应该是环，跟原始模板一样的环，除了突变的位点。
2.DpnI消化的是混在PCR产物中的被甲基化的原始模板，剩下的是突变成功的环状DNA。
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生活是面镜子~
2楼2012-03-31 22:57:25
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黑沉

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by to-be at 2012-03-31 22:57:25:
1.PCR产物应该是环，跟原始模板一样的环，除了突变的位点。
2.DpnI消化的是混在PCR产物中的被甲基化的原始模板，剩下的是突变成功的环状DNA。

我PCR产物小量跑了下电泳，质粒线性化大小的片段最亮，所以我怀疑这个PCR产物是不是就是线性化的。
我已经用.DpnI消化后转化了，结果还不知道，先等着，呵呵。
谢谢你哈，我现在就只想弄清楚这个PCR产物到底是环状的还是线性化的，呵呵……
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3楼2012-03-31 23:02:36
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to-be

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 黑沉 at 2012-03-31 23:02:36:
我PCR产物小量跑了下电泳，质粒线性化大小的片段最亮，所以我怀疑这个PCR产物是不是就是线性化的。
我已经用.DpnI消化后转化了，结果还不知道，先等着，呵呵。
谢谢你哈，我现在就只想弄清楚这个PCR产物到底是 ...

你怎么跑的电泳？Marker，有质粒对照？怎么就确定是线性化？
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生活是面镜子~
4楼2012-03-31 23:19:07
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黑沉

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by to-be at 2012-03-31 23:19:07:
你怎么跑的电泳？Marker，有质粒对照？怎么就确定是线性化？

Marker和质粒对照都一起跑了，质粒线性化大小的条带很亮，质粒大小的条带就暗了很多了，这应该就是扩增出线性化的产物了吧。
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5楼2012-04-01 09:53:32
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痞子无敌

金虫 (正式写手)
师兄，看到你这个帖子，我想知道引物要怎样设计才可以有环状产物这样的结果？前后引物是要完全互补还是只需要有几bp的互补？如果互补的话，退火的时候引物不会形成二聚体吗？
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当你当你的眼睛眯着笑
6楼2016-11-29 13:51:03
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你的PCR产物是线状的，有缺口的一个片段，但是e.coli会把这个缺口修复。你可以在网上找一下  Stratagene QuikChange，这个的使用说明书，上面有很详细的说明
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上班族，学习ing……
7楼2016-12-01 10:59:47
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