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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】定点突变-DpnI消化
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04swlcm

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】定点突变-DpnI消化已有8人参与

大家好：
      我最近做定点突变，采用反向PCR方法扩整个质粒+基因片段（突变位点设计在两互补的突变引物中间），高保真酶跑20个循环，直接在20uLPCR产物中加入1uLDpnI消化3h，取10uL转化JM109，涂Amp平板，一颗菌未长，郁闷中，请大家帮忙！这种突变方法需要注意些什么呢？
     请问DpnI消化前或后需要纯化吗？我没有，好些资料上也说不需要纯化。
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1楼2010-10-22 11:15:16
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回帖置顶 ( 共有1个 )

星嗲

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5):新虫鼓励交流。 2010-11-02 17:08:08
gyesang: 回帖置顶 2014-07-29 18:57:45
PCR产物消化前是不用纯化的。
你可以做50ul的体系，做25个循环，用好一点的聚合Mei，P完后点8ul上样跑个胶，观察是否看得见你要的条带。
看不见也不要紧，接下来就可以用DpnI消化了。
转化用的感受态最好要效率高一点。
祝你好运！
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7楼2010-11-02 16:26:02
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chinosaur

木虫 (正式写手)

求购IQ卡
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼上的好像完全不懂定点突变的原理啊！去找个官方的介绍看看再说吧。
我做过不少点突变，各种各样的，同时突变几个的，加进去的，减少的，随意改变连续7个以内氨基酸残基的我都做过，一次成功率几乎100%，应该说这种方法是非常强大的。关键就在PCR这步，我做的时候会按照protocol上做对照，如果你PCR做出来的条带比对照的明显亮很多，那基本上就成功了。
引物的设计也是关键，原protocol上说的引物设计方法效率非常差，最好的设计方法是两条引物3端分别突出一段。这两个地方弄好了，基本上就没问题了。

另外，DpnI消化之前不用纯化，直接把酶加到反应体系里混匀然后放37度就行了。推荐转化时用DMT菌株，这种菌株有和DpnI相似的功能，能把模板链消化掉，使成功率更加接近100%。如果没有这种菌株，可以将酶切时间从1小时延长到2-3个小时。

[ Last edited by chinosaur on 2010-11-3 at 15:12 ]
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9楼2010-11-03 15:06:18
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 04swlcm at 2010-10-22 13:42:31:




那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢

P完跑胶看是否有质粒大小条带。确认P出来了再消化。
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仕不可不弘毅，任重而道远
5楼2010-10-22 13:52:22
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普通回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
最好纯化
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2楼2010-10-22 11:37:12
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
感觉问题不是出在消化这一步了。消化不好应该有菌落长出来才对！

认为是在PCR扩增问题。
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3楼2010-10-22 12:34:56
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-10-22 12:34:56:
感觉问题不是出在消化这一步了。消化不好应该有菌落长出来才对！

认为是在PCR扩增问题。

那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢
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4楼2010-10-22 13:42:31
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 04swlcm at 2010-10-22 13:42:31:




那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢

没有很好的方法，单纯的看大小和扩增出来没有意义并不大。

注重引物的设计，如果重复几次没有结果就换成粘性末端的引物试试，也许可以。
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6楼2010-10-22 18:54:03
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
先请教个问题，DpnI消化的目的是什么？还有我查了NEB的说明书，DpnI只有在识别位点被甲基化后才可以切割，通过PCR方法扩出来的产物是完全不会被甲基化的，所以你的这一步消化一点作用都没有。如果鉴定PCR产物是否正确能不能拿突变之前的模板一起跑个胶看带型一不一样呢，或者把产物做一下单酶切，看大小正确吗。祝你成功

[ Last edited by 空谷幽风 on 2010-11-3 at 14:33 ]
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
8楼2010-11-03 14:31:59
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yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
想问一下楼上，我正在做定点突变这个实验，用DpnI酶切时间需要一个小时那么久吗？我看的这个说明书上说只需要5分钟就好了！但是，按照说明书上做下来并没有长出菌落，而且你一般做转化时用的感受态一般是多少啊，我这个说明书上说45μl，总感觉少了点！而且，你热激的时间是30s还是90s啊？你在做复苏菌体是培养基是用的LB还是NZYMa啊？我这边问题很多，还望能帮忙解答！！谢谢！
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学会克服贪念，提升自己！
10楼2012-10-12 16:12:35
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