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04swlcm
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【求助/交流】定点突变-DpnI消化 已有8人参与
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大家好： 我最近做定点突变，采用反向PCR方法扩整个质粒+基因片段（突变位点设计在两互补的突变引物中间），高保真酶跑20个循环，直接在20uLPCR产物中加入1uLDpnI消化3h，取10uL转化JM109，涂Amp平板，一颗菌未长，郁闷中，请大家帮忙！这种突变方法需要注意些什么呢？ 请问DpnI消化前或后需要纯化吗？我没有，好些资料上也说不需要纯化。 |
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7楼2010-11-02 16:26:02
chinosaur
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楼上的好像完全不懂定点突变的原理啊！去找个官方的介绍看看再说吧。 我做过不少点突变，各种各样的，同时突变几个的，加进去的，减少的，随意改变连续7个以内氨基酸残基的我都做过，一次成功率几乎100%，应该说这种方法是非常强大的。关键就在PCR这步，我做的时候会按照protocol上做对照，如果你PCR做出来的条带比对照的明显亮很多，那基本上就成功了。 引物的设计也是关键，原protocol上说的引物设计方法效率非常差，最好的设计方法是两条引物3端分别突出一段。这两个地方弄好了，基本上就没问题了。 另外，DpnI消化之前不用纯化，直接把酶加到反应体系里混匀然后放37度就行了。推荐转化时用DMT菌株，这种菌株有和DpnI相似的功能，能把模板链消化掉，使成功率更加接近100%。如果没有这种菌株，可以将酶切时间从1小时延长到2-3个小时。 [ Last edited by chinosaur on 2010-11-3 at 15:12 ] |
9楼2010-11-03 15:06:18
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6楼2010-10-22 18:54:03
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