应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】定点突变-DpnI消化
51/1返回列表
查看: 8377  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

04swlcm

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】定点突变-DpnI消化 已有8人参与

大家好：
      我最近做定点突变，采用反向PCR方法扩整个质粒+基因片段（突变位点设计在两互补的突变引物中间），高保真酶跑20个循环，直接在20uLPCR产物中加入1uLDpnI消化3h，取10uL转化JM109，涂Amp平板，一颗菌未长，郁闷中，请大家帮忙！这种突变方法需要注意些什么呢？
     请问DpnI消化前或后需要纯化吗？我没有，好些资料上也说不需要纯化。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 有价值的生物经验贴

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-10-22 11:15:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-10-22 12:34:56:
感觉问题不是出在消化这一步了。消化不好应该有菌落长出来才对！

认为是在PCR扩增问题。

那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢
赞一下 回复此楼
4楼2010-10-22 13:42:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

月月大可

木虫 (著名写手)
★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
感觉问题不是出在消化这一步了。消化不好应该有菌落长出来才对！

认为是在PCR扩增问题。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-10-22 12:34:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 04swlcm at 2010-10-22 13:42:31:




那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢

P完跑胶看是否有质粒大小条带。确认P出来了再消化。
赞一下(2人) 回复此楼
仕不可不弘毅，任重而道远
5楼2010-10-22 13:52:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 04swlcm at 2010-10-22 13:42:31:




那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢

没有很好的方法，单纯的看大小和扩增出来没有意义并不大。

注重引物的设计，如果重复几次没有结果就换成粘性末端的引物试试，也许可以。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-10-22 18:54:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭