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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】定点突变-DpnI消化
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04swlcm

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】定点突变-DpnI消化 已有8人参与

大家好：
      我最近做定点突变，采用反向PCR方法扩整个质粒+基因片段（突变位点设计在两互补的突变引物中间），高保真酶跑20个循环，直接在20uLPCR产物中加入1uLDpnI消化3h，取10uL转化JM109，涂Amp平板，一颗菌未长，郁闷中，请大家帮忙！这种突变方法需要注意些什么呢？
     请问DpnI消化前或后需要纯化吗？我没有，好些资料上也说不需要纯化。
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1楼 2010-10-22 11:15:16
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chinosaur

木虫 (正式写手)

求购IQ卡
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼上的好像完全不懂定点突变的原理啊！去找个官方的介绍看看再说吧。
我做过不少点突变，各种各样的，同时突变几个的，加进去的，减少的，随意改变连续7个以内氨基酸残基的我都做过，一次成功率几乎100%，应该说这种方法是非常强大的。关键就在PCR这步，我做的时候会按照protocol上做对照，如果你PCR做出来的条带比对照的明显亮很多，那基本上就成功了。
引物的设计也是关键，原protocol上说的引物设计方法效率非常差，最好的设计方法是两条引物3端分别突出一段。这两个地方弄好了，基本上就没问题了。

另外，DpnI消化之前不用纯化，直接把酶加到反应体系里混匀然后放37度就行了。推荐转化时用DMT菌株，这种菌株有和DpnI相似的功能，能把模板链消化掉，使成功率更加接近100%。如果没有这种菌株，可以将酶切时间从1小时延长到2-3个小时。

[ Last edited by chinosaur on 2010-11-3 at 15:12 ]
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9楼2010-11-03 15:06:18
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
感觉问题不是出在消化这一步了。消化不好应该有菌落长出来才对！

认为是在PCR扩增问题。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-10-22 12:34:56
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-10-22 12:34:56:
感觉问题不是出在消化这一步了。消化不好应该有菌落长出来才对！

认为是在PCR扩增问题。

那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢
赞一下 回复此楼
4楼2010-10-22 13:42:31
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 04swlcm at 2010-10-22 13:42:31:




那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢

P完跑胶看是否有质粒大小条带。确认P出来了再消化。
赞一下(2人) 回复此楼
仕不可不弘毅，任重而道远
5楼2010-10-22 13:52:22
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