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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】定点突变-DpnI消化
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厚德求是

金虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-29 19:01:40
一方面可能是你PCR过程出现问题，一般用Dpn1消化之前，先跑电泳，看看有没有大概大小正常的条带，如果有的话再去做转化。
另一方面可能是感受态细胞的问题。建议把模板质粒也导入JM109做平行对照。
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11楼2014-07-12 14:54:53
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-29 19:01:29
引用回帖:
8楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2010-11-03 14:31:59
先请教个问题，DpnI消化的目的是什么？还有我查了NEB的说明书，DpnI只有在识别位点被甲基化后才可以切割，通过PCR方法扩出来的产物是完全不会被甲基化的，所以你的这一步消化一点作用都没有。如果鉴定PCR产物是否正 ...

DPNI的作用就是把你的模板消化掉

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天道酬勤
12楼2014-07-12 23:14:35
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yuqianswim

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一般用的质粒都是经过细菌增殖的，细菌里面都有甲基化的酶，所以一般链接上目的片段的重组载体可以被DpnI消化掉，而定点突变用的是PCR的方法，这样扩增的重组质粒是不被甲基化的，所以不能被切掉。所以，PCR之后再用DpnI消化就可以去掉模板的重组质粒，进而可以在挑去克隆的时候排除掉挑取假阳性的可能性。
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13楼2015-05-29 10:47:06
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