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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 进行点突变的pcr，不能扩增出产物
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846713697

新虫 (初入文坛)

[求助] 进行点突变的pcr，不能扩增出产物

想要将一个碱基突变掉，但是质粒本身很大有13kb左右，用Takara prime star gxl进行pcr，60度，62度，64度都试过退火温度，16min延伸时间，但是pcr不出东西，引物GC含量较低，求教高人！
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1楼2012-09-16 19:41:50
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-17 13:50:19
你想为了突变一个碱基而扩增整个质粒？我觉得这个有点难度的吧，而且质粒还这么大。我做突变的方法是在要突变点的附近找一个酶切位点，另一个地方也找一个酶切位点，在引物中引入突变位点，然后P出两个酶切位点之间的片段，然后将P出的片段和质粒进行重组，筛选即得到突变后的质粒。
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2楼2012-09-16 22:57:11
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三十不惑

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-17 13:50:31
楼主的方法是可行的，我就是这么做的。这是按照stratagene的QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit 方法来做的。不知道楼主用的引物长度是多少？你可以去网上下载一下这个Kit的说明说，参考一下里面的内容，GC含量低的话引物长度加长点即可。
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3楼2012-09-17 09:05:45
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littlestove

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
stratagene里的方法对大片段还是挺难的，可以采用重叠延伸的方法突变,原理可参照北京全式金生物技术有限公司Easy Mutagenesis Systemhttp://www.biomart.cn/infosupply/6341580.htm。可以自己买酶按其原理操作，突变很容易成功
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4楼2012-09-19 17:22:30
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