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846713697

新虫 (初入文坛)

[求助] 进行点突变的pcr,不能扩增出产物

想要将一个碱基突变掉,但是质粒本身很大有13kb左右,用Takara prime star gxl进行pcr,60度,62度,64度都试过退火温度,16min延伸时间,但是pcr不出东西,引物GC含量较低,求教高人!
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-17 13:50:19
你想为了突变一个碱基而扩增整个质粒?我觉得这个有点难度的吧,而且质粒还这么大。我做突变的方法是在要突变点的附近找一个酶切位点,另一个地方也找一个酶切位点,在引物中引入突变位点,然后P出两个酶切位点之间的片段,然后将P出的片段和质粒进行重组,筛选即得到突变后的质粒。
2楼2012-09-16 22:57:11
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三十不惑

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-17 13:50:31
楼主的方法是可行的,我就是这么做的。这是按照stratagene的QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit 方法来做的。不知道楼主用的引物长度是多少?你可以去网上下载一下这个Kit的说明说,参考一下里面的内容,GC含量低的话引物长度加长点即可。
个性签名
3楼2012-09-17 09:05:45
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littlestove

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
stratagene里的方法对大片段还是挺难的,可以采用重叠延伸的方法突变,原理可参照北京全式金生物技术有限公司Easy Mutagenesis Systemhttp://www.biomart.cn/infosupply/6341580.htm。可以自己买酶按其原理操作,突变很容易成功
4楼2012-09-19 17:22:30
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