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一凡8665

金虫 (小有名气)

[交流] PCR扩增问题

Sample Text
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大家好!我初次做PCR扩增一个细菌的16Sr DNA，引物和扩增条件都是按照文献来的，但是奇怪的是PCR结束后电泳发现，引物和模板没有结合，这是什么原因呢？谢谢大家的释疑！
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1楼 2011-11-03 20:31:41
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yesucao

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
一凡8665(金币+1): 2011-11-04 09:14:00
一凡8665(金币+4): 2011-11-16 16:51:44
可能的原因：细菌DNA的提取过程中，存在较多的蛋白没有去除干净；加样过程中个人的操作；Taq酶失活，扩增的条件也可是适当的优化一下。分析的原因不多，见谅！！
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2楼2011-11-03 20:51:14
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zhfge

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
好吧，你检测过模板么？
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3楼2011-11-03 23:22:23
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张建荣

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
一凡8665(金币+1): 2011-11-04 09:14:06
一凡8665(金币+1): 2011-11-16 16:51:59
模板和引物没有结合原因很多，但主要的原因是退火温度有点高，使模板和引物没有没有配对，做实验时有时看着经典步骤做了，还是不出结果，这就关键里面还有一个自己的摸索过程，那点自己摸索出来的东西作者一般是不会分享的，
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4楼2011-11-04 00:39:11
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 问得好哦~欢迎新虫参与交流！ 2011-11-04 23:52:28
非常奇怪LZ怎么看得出是模板与引物没有结合的呢？

会不会是PCR本身的问题？是否有做阳性及阴性对照。
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6楼2011-11-04 09:41:00
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wjgang728

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你怎么确定引物和模板没有结合呢？基于什么来确定的？
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7楼2011-11-04 09:53:02
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sunjump

至尊木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
同样关注这类问题
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8楼2011-11-04 10:03:59
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hxw321

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
一凡8665(金币+3): 2011-11-16 16:52:13
根据Tm值，做一个温度梯度看看。另外，不同的引物设计软件可能Tm值不一样，还是自己设计的好。
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9楼2011-11-04 10:40:06
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imyting

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
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西瓜(金币+1): Good！ 2011-11-04 23:53:00
P不出来的原因太复杂了，不同的人做，条件一样可能都做不出来，这种事情还是自己摸索的好。大家的意见只能是参考，毕竟自己的事只有自己最清楚^^我也经常遇到这种情况啊
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10楼2011-11-04 12:07:39
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一凡8665

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhfge at 2011-11-03 23:22:23:
好吧，你检测过模板么？

你好！检测过，不过有点断裂，情况不严重。
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11楼2011-11-04 13:12:50
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一凡8665

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wjgang728 at 2011-11-04 09:53:02:
你怎么确定引物和模板没有结合呢？基于什么来确定的？

你好！因为PCR后跑胶发现除了marker外的亮带都在最前面。
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12楼2011-11-04 13:14:18
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一凡8665

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by longrna at 2011-11-04 09:41:00:
非常奇怪LZ怎么看得出是模板与引物没有结合的呢？

会不会是PCR本身的问题？是否有做阳性及阴性对照。

没做对照。
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13楼2011-11-04 13:15:16
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一凡8665

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by imyting at 2011-11-04 12:07:39:
P不出来的原因太复杂了，不同的人做，条件一样可能都做不出来，这种事情还是自己摸索的好。大家的意见只能是参考，毕竟自己的事只有自己最清楚^^我也经常遇到这种情况啊

谢谢！
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14楼2011-11-04 13:15:56
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江苏虞游

木虫 (正式写手)
★
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把反应参数发过来，帮你看看
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16楼2011-11-04 13:47:37
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晕倒狸

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
学术讨论着啊！！
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17楼2011-11-04 13:49:42
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weixinsu123

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by imyting at 2011-11-04 12:07:39:
P不出来的原因太复杂了，不同的人做，条件一样可能都做不出来，这种事情还是自己摸索的好。大家的意见只能是参考，毕竟自己的事只有自己最清楚^^我也经常遇到这种情况啊

同意楼上的观点，你的PCR没结果出来，不见得就是引物和模板没有结合，况且这一步也看不出来。。。
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18楼2011-11-04 20:43:31
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dragoner

新虫 (小有名气)
★
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估计还是引物设计的问题
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19楼2011-11-05 01:39:36
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lixiangke

金虫 (小有名气)
★
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设立阴性对照，在优化PCR条件……
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20楼2011-11-05 09:08:59
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
★ ★
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西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-11-05 23:52:05
一凡8665(金币+4): 2011-11-16 16:52:42
DNA模板加的量要控制好，最好把模板稀释100-1000倍，另外退火温度掌握好，
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21楼2011-11-05 09:43:18
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congcongyrl

铁虫 (初入文坛)
★
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一凡8665(金币+1): 2011-11-16 16:52:48
问题本身有点模糊。引物和模板没有结合？如何判断？是因为没有扩增产物？那样的原因太多了啊。
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22楼2011-11-05 20:49:51
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zhouenlai5555楼
2011-11-04 01:11   回复  
sunye15楼
2011-11-04 13:39   回复  
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