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遥望87

银虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增结果

最近在扩增某基因的中间片段,刚开始时PCR结果经电泳检测有条带,后来在相同的条件下(PCR反应条件、cDNA及所用的试剂均一样)却怎么也扩不出来了,是引物的问题吗?(引物为简并引物,另外cDNA已用内参检验过,没有问题)。该问题已困扰鄙人很久了,望高手指点。非常感谢!
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夜空中最亮的星!
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+1): 设置正确的对照很重要! 2012-03-09 23:46:56
遥望87(金币+3): 有帮助 谢谢! 2012-03-11 10:12:24
建议你将内参的扩增和目的基因片度的扩增同时进行,设置阴性和阳性对照是发现问题的最好办法
2楼2012-03-09 07:59:48
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szylnl

银虫 (小有名气)

是不是cDNA时间长了啊
用百分之百的努力去做每件事
3楼2012-03-09 08:57:42
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遥望87

银虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by szylnl at 2012-03-09 08:57:42:
是不是cDNA时间长了啊

不会吧,中间也就只隔两三天,而且cDNA一直都放在-40的冰箱里的
夜空中最亮的星!
4楼2012-03-09 10:29:59
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boqikang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励新虫!欢迎常来啊! 2012-03-09 23:47:20
我也遇到过此问题。最后我用PCR产物再一次PCR了一次,最后有了条带。我感觉是不是dna浓度太小了,或是DNA浓度不均匀。你看看吧
5楼2012-03-09 12:27:23
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Pushing2012

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
遥望87(金币+1): 有帮助 应该没有,谢谢! 2012-03-11 10:13:23
DNA跟引物的浓度有问题没得
6楼2012-03-09 12:44:24
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yaoyaozhd

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
遥望87(金币+2): 有帮助 谢谢! 2012-03-11 10:12:56
确定一下所用的试剂、模板、引物有没有问题吧;也可以换别的温度试试,别在一棵树上吊死
7楼2012-03-09 21:43:28
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yiyi12

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励应助! 2012-03-11 16:17:38
是不是cDNA浓度不匀?用之前搅匀再吸取呢?还有简并引物是不是反复冻融次数太多了?
8楼2012-03-10 17:18:52
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遥望87

银虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by boqikang at 2012-03-09 12:27:23:
我也遇到过此问题。最后我用PCR产物再一次PCR了一次,最后有了条带。我感觉是不是dna浓度太小了,或是DNA浓度不均匀。你看看吧

那你后来跑出的条带是你的目的条带吗?
夜空中最亮的星!
9楼2012-03-11 10:12:01
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盛宏霞

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我最近也遇到这样的问题,引物刚合成时做了次PCR,都扩增出来目的条带,后来在相同的条件下就是没有目的条带,但是感觉有引物二聚体的产生,如果有高手帮忙解决下吧!
10楼2012-03-29 09:35:49
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