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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 16S PCR扩增的问题
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lzhaowin

木虫 (小有名气)

[求助] 16S PCR扩增的问题

上周五做的16S PCR，扩增效果很好，而且做了连接和转化~
周日发现Taq E结冰了，重新订了新的Taq E。
周二再重复做16S PCR的时候就发现没有目的条带，阳性对照条带很弱。怀疑是dNTPs快用完了，有可能降解了，所以换了新的dNTPs，结果电泳检测杯具的发现神马都没有！
后来接着重新稀释100uM的引物母液至10uM，又换了实验室另一种Taq E同样是没有条带，阳性对照很弱。
怀疑是现在用的模板降解了？今天重复了上周五用的模板，结果还是悲催的没有任何条带？为什么呀？为什么？上周能做出来，这周就不行了！
望各路大侠赐教~
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1楼 2011-04-28 16:41:18
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zemin_fang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-28 19:35:09
lzhaowin(金币+3): 谢谢~水我也换过了，还是不解决问题~ 2011-04-28 21:38:59
鉴于上述情况，建议你先仔细核对你的PCR程序是否被他人改动。如果程序前后未动，对于PCR来说，反应体系中含有如下成分：buffer、模板、dNTP、引物、酶以及用于补足体积的水。你尝试过跟换引物、酶、dNTP，那么就再更换剩下的几种吧。不要忽略水，如果水被污染也会导致PCR失败。
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2楼2011-04-28 16:57:22
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wallace974

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 奖励，辛苦了。 2011-04-28 19:35:16
lzhaowin(金币+3): 我写“E”就是“酶”的意思~用的就是普通的Taq酶~谢谢~ 2011-04-28 21:40:38
为什么用taq E呢？普通的Taq不就可以了，而且还结冰了，普通的taq也不会结冰啊，建议换普通taq，72度延伸时间设定为2min就可以了。模板可以直接取1uL菌液或一个单克隆，PCR程序设定95度5分钟就可以裂解细胞，16S比较好扩的。
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万物一理，万法自然
3楼2011-04-28 17:06:19
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zmw_520

禁虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励分享经验。 2011-04-28 19:35:25
lzhaowin(金币+3): 谢谢你的经验~ 2011-04-28 21:42:10
本帖内容被屏蔽
4楼2011-04-28 17:34:47
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+3): 谢谢你的经验~ 2011-04-29 09:05:20
好多年前遇到过类似问题，整个体系换了一下。尤其是dNTP和酶最关键。检查一下buffer是否是一种是含镁的一种不含？这个很重要。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
5楼2011-04-28 23:44:35
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chen4

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+3): 谢谢你的提示~ 2011-04-29 09:06:42
引用回帖:
Originally posted by lzhaowin at 2011-04-28 16:41:18:
上周五做的16S PCR，扩增效果很好，而且做了连接和转化~
周日发现Taq E结冰了，重新订了新的Taq E。
周二再重复做16S PCR的时候就发现没有目的条带，阳性对照条带很弱。怀疑是dNTPs快用完了，有可能降解了，所以 ...

我实验室一同学之前也遇到过和你你一样的情况。所以从引物，模板还有酶上面找原因吧，用别人的酶和引物（和自己的一样的）结果有目的片段，最后发现自己的酶出了问题。遇到这样的问题先别急，用排除法慢慢试一试就能解决的。祝你好运！
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棒棒
6楼2011-04-29 00:07:17
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xyj114114

木虫 (著名写手)
需要认真，带实验结果好的时间要赶紧做，有多种原因导致失败，如机器换，或别人改了程序，还有你配置的混合体系，是否不准确，还有移液器等，很多原因，还有用的琼脂糖，电泳液等都可能对你的实验结果早成影响的。
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7楼2011-04-29 00:30:27
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ddrflying

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+2): 2011-04-29 16:02:25
同意楼上各位的说法，就要单因素一个一个的试验。
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8楼2011-04-29 13:48:46
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东林党人

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+2): 谢谢~ 2011-04-30 22:53:54
我现在也正准备做16SDNA 扩增，我感觉可能会在酶和模板上出问题。如果排除了这两个原因，就得挨个排除其他原因了。
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9楼2011-04-30 08:51:28
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+2): 谢谢~以前也很容易就出来了，现在不知怎么回事~ 2011-04-30 23:14:19
肯能是引物的原因。引物在稀释以后，放置容易降解，可以选择重新稀释引物。16s 很好扩的 随便坐坐都能出来的
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10楼2011-04-30 09:41:10
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