24小时热门版块排行榜    

查看: 3508  |  回复: 11
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

lzhaowin

木虫 (小有名气)

[求助] 16S PCR扩增的问题

上周五做的16S PCR,扩增效果很好,而且做了连接和转化~
周日发现Taq E结冰了,重新订了新的Taq E。
周二再重复做16S PCR的时候就发现没有目的条带,阳性对照条带很弱。怀疑是dNTPs快用完了,有可能降解了,所以换了新的dNTPs,结果电泳检测杯具的发现神马都没有!
后来接着重新稀释100uM的引物母液至10uM,又换了实验室另一种Taq E同样是没有条带,阳性对照很弱。
怀疑是现在用的模板降解了?今天重复了上周五用的模板,结果还是悲催的没有任何条带?为什么呀?为什么?上周能做出来,这周就不行了!
望各路大侠赐教~
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chen4

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+3): 谢谢你的提示~ 2011-04-29 09:06:42
引用回帖:
Originally posted by lzhaowin at 2011-04-28 16:41:18:
上周五做的16S PCR,扩增效果很好,而且做了连接和转化~
周日发现Taq E结冰了,重新订了新的Taq E。
周二再重复做16S PCR的时候就发现没有目的条带,阳性对照条带很弱。怀疑是dNTPs快用完了,有可能降解了,所以 ...

我实验室一同学之前也遇到过和你你一样的情况。所以从引物,模板还有酶上面找原因吧,用别人的酶和引物(和自己的一样的)结果有目的片段,最后发现自己的酶出了问题。遇到这样的问题先别急,用排除法慢慢试一试就能解决的。祝你好运!
棒棒
6楼2011-04-29 00:07:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

zemin_fang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-28 19:35:09
lzhaowin(金币+3): 谢谢~水我也换过了,还是不解决问题~ 2011-04-28 21:38:59
鉴于上述情况,建议你先仔细核对你的PCR程序是否被他人改动。如果程序前后未动,对于PCR来说,反应体系中含有如下成分:buffer、模板、dNTP、引物、酶以及用于补足体积的水。你尝试过跟换引物、酶、dNTP,那么就再更换剩下的几种吧。不要忽略水,如果水被污染也会导致PCR失败。
2楼2011-04-28 16:57:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wallace974

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 奖励,辛苦了。 2011-04-28 19:35:16
lzhaowin(金币+3): 我写“E”就是“酶”的意思~用的就是普通的Taq酶~谢谢~ 2011-04-28 21:40:38
为什么用taq E呢?普通的Taq不就可以了,而且还结冰了,普通的taq也不会结冰啊,建议换普通taq,72度延伸时间设定为2min就可以了。模板可以直接取1uL菌液或一个单克隆,PCR程序设定95度5分钟就可以裂解细胞,16S比较好扩的。
万物一理,万法自然
3楼2011-04-28 17:06:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zmw_520

禁虫 (小有名气)

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励分享经验。 2011-04-28 19:35:25
lzhaowin(金币+3): 谢谢你的经验~ 2011-04-28 21:42:10
本帖内容被屏蔽

4楼2011-04-28 17:34:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 基金不中,共勉 +10 eulota 2026-08-26 10/500 2026-08-27 17:23 by lqllinqiaoli
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+5) +10 晴天加油 2026-08-26 11/550 2026-08-27 16:35 by msuhlx
[基金申请] 看板上这么多中的,有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜? 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 怎么查啊 +5 huang1991js 2026-08-26 5/250 2026-08-26 16:09 by Equinoxhua
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +22 羊腰板 2026-08-21 25/1250 2026-08-26 15:00 by zuocuiping
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件,有关系吗? +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 牛来!米来!面来! +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候,我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 某些机构,以效率低为荣,以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑,不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[基金申请] 看来今天不会放榜了? +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
信息提示
请填处理意见