应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 16S PCR扩增的问题
121/2返回列表12下一页
查看: 3493  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lzhaowin

木虫 (小有名气)

[求助] 16S PCR扩增的问题

上周五做的16S PCR，扩增效果很好，而且做了连接和转化~
周日发现Taq E结冰了，重新订了新的Taq E。
周二再重复做16S PCR的时候就发现没有目的条带，阳性对照条带很弱。怀疑是dNTPs快用完了，有可能降解了，所以换了新的dNTPs，结果电泳检测杯具的发现神马都没有！
后来接着重新稀释100uM的引物母液至10uM，又换了实验室另一种Taq E同样是没有条带，阳性对照很弱。
怀疑是现在用的模板降解了？今天重复了上周五用的模板，结果还是悲催的没有任何条带？为什么呀？为什么？上周能做出来，这周就不行了！
望各路大侠赐教~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-04-28 16:41:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zemin_fang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-28 19:35:09
lzhaowin(金币+3): 谢谢~水我也换过了，还是不解决问题~ 2011-04-28 21:38:59
鉴于上述情况，建议你先仔细核对你的PCR程序是否被他人改动。如果程序前后未动，对于PCR来说，反应体系中含有如下成分：buffer、模板、dNTP、引物、酶以及用于补足体积的水。你尝试过跟换引物、酶、dNTP，那么就再更换剩下的几种吧。不要忽略水，如果水被污染也会导致PCR失败。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-04-28 16:57:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wallace974

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 奖励，辛苦了。 2011-04-28 19:35:16
lzhaowin(金币+3): 我写“E”就是“酶”的意思~用的就是普通的Taq酶~谢谢~ 2011-04-28 21:40:38
为什么用taq E呢？普通的Taq不就可以了，而且还结冰了，普通的taq也不会结冰啊，建议换普通taq，72度延伸时间设定为2min就可以了。模板可以直接取1uL菌液或一个单克隆，PCR程序设定95度5分钟就可以裂解细胞，16S比较好扩的。
赞一下(1人) 回复此楼
万物一理，万法自然
3楼2011-04-28 17:06:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zmw_520

禁虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励分享经验。 2011-04-28 19:35:25
lzhaowin(金币+3): 谢谢你的经验~ 2011-04-28 21:42:10
本帖内容被屏蔽
4楼2011-04-28 17:34:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+3): 谢谢你的经验~ 2011-04-29 09:05:20
好多年前遇到过类似问题，整个体系换了一下。尤其是dNTP和酶最关键。检查一下buffer是否是一种是含镁的一种不含？这个很重要。
赞一下 回复此楼
寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
5楼2011-04-28 23:44:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chen4

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+3): 谢谢你的提示~ 2011-04-29 09:06:42
引用回帖:
Originally posted by lzhaowin at 2011-04-28 16:41:18:
上周五做的16S PCR，扩增效果很好，而且做了连接和转化~
周日发现Taq E结冰了，重新订了新的Taq E。
周二再重复做16S PCR的时候就发现没有目的条带，阳性对照条带很弱。怀疑是dNTPs快用完了，有可能降解了，所以 ...

我实验室一同学之前也遇到过和你你一样的情况。所以从引物，模板还有酶上面找原因吧，用别人的酶和引物（和自己的一样的）结果有目的片段，最后发现自己的酶出了问题。遇到这样的问题先别急，用排除法慢慢试一试就能解决的。祝你好运！
赞一下 回复此楼
棒棒
6楼2011-04-29 00:07:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xyj114114

木虫 (著名写手)
需要认真，带实验结果好的时间要赶紧做，有多种原因导致失败，如机器换，或别人改了程序，还有你配置的混合体系，是否不准确，还有移液器等，很多原因，还有用的琼脂糖，电泳液等都可能对你的实验结果早成影响的。
赞一下 回复此楼
7楼2011-04-29 00:30:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ddrflying

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+2): 2011-04-29 16:02:25
同意楼上各位的说法，就要单因素一个一个的试验。
赞一下 回复此楼
8楼2011-04-29 13:48:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

东林党人

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+2): 谢谢~ 2011-04-30 22:53:54
我现在也正准备做16SDNA 扩增，我感觉可能会在酶和模板上出问题。如果排除了这两个原因，就得挨个排除其他原因了。
赞一下 回复此楼
9楼2011-04-30 08:51:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

lzhaowin(金币+2): 谢谢~以前也很容易就出来了，现在不知怎么回事~ 2011-04-30 23:14:19
肯能是引物的原因。引物在稀释以后，放置容易降解，可以选择重新稀释引物。16s 很好扩的 随便坐坐都能出来的
赞一下 回复此楼
10楼2011-04-30 09:41:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lzhaowin 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +11 angus9576 2026-08-25 11/550 2026-08-25 17:08 by ZJTJZ
[基金申请] 有没有大神帮我看看基金代码 28+3 1234567wang 2026-08-24 9/450 2026-08-25 16:51 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 +6 ziyangfang 2026-08-25 8/400 2026-08-25 16:28 by 宝贝的猪
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 22/1100 2026-08-25 15:36 by 医学老男孩
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 18/900 2026-08-25 14:50 by Weed114114
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +5 process2012 2026-08-23 7/350 2026-08-25 09:42 by huixian257
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +17 kkkl_v 2026-08-19 18/900 2026-08-25 09:41 by windflowerwy
[基金申请] 我面上完蛋了 +13 且听虎啸 2026-08-20 14/700 2026-08-25 09:10 by mrkang
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +7 炎黄贵胄 2026-08-22 8/400 2026-08-25 08:48 by ZJTJZ
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +25 yaoyewhu2008 2026-08-20 27/1350 2026-08-25 08:01 by Equinoxhua
[基金申请] 明天应该可查了！？ +5 chengyan1220 2026-08-23 5/250 2026-08-24 23:28 by 我4大白菜
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭