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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR没有结果，希望高手指教
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独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR没有结果，希望高手指教 已有9人参与

我最近做了一个PCR，有的模板能扩出来，有的模板扩不出来，条件都是一样的，肯定就是模板的原因了。15μL体系，模板加3μL。有的模板很稠，吸不上来。问一下，是不是反应体系中模板浓度太高了也会抑制PCR扩增啊？还是太稠了，DNA没有完全溶解，没怎么吸到DNA模板的原因（也就是相应地反应体系中模板浓度太低）？我今天把DNA原液在60℃水浴了一下，有的DNA还是很粘稠。
        求高手解决啊！
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1楼 2010-12-23 10:52:42
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feng__

金虫 (著名写手)

雾~蝶
★ ★
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看天(金币+1):鼓励回答 2010-12-23 12:30:03
是DNA浓度太高了，再多稀释几倍，而且我们一般做20微升体系也才加1微升，你加的太多了，模板多了应该会有非特异条带，也许也会导致P不出来吧，样品多稀释几倍再试试看！好运！
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会不会偶尔也会想起我....
2楼2010-12-23 11:01:50
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feng__

金虫 (著名写手)

雾~蝶
貌似大家PCR的问题也很多，也开个专题吧
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会不会偶尔也会想起我....
3楼2010-12-23 11:03:36
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adslye

银虫 (正式写手)
★ ★
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看天(金币+1):鼓励交流 2010-12-23 12:30:15
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Originally posted by 独孤蚕 at 2010-12-23 10:52:42:
我最近做了一个PCR，有的模板能扩出来，有的模板扩不出来，条件都是一样的，肯定就是模板的原因了。15μL体系，模板加3μL。有的模板很稠，吸不上来。问一下，是不是反应体系中模板浓度太高了也会抑制PCR扩增啊？ ...

你的是植物基因组？太稠了很可能不是基因组是多糖和基因组的混合物。多糖为主。总之，几乎不会出现提的基因组变成很粘稠，那太浓了。除非是大量浓缩的。
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4楼2010-12-23 11:04:13
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
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Originally posted by 独孤蚕 at 2010-12-23 10:52:42:
我最近做了一个PCR，有的模板能扩出来，有的模板扩不出来，条件都是一样的，肯定就是模板的原因了。15μL体系，模板加3μL。有的模板很稠，吸不上来。问一下，是不是反应体系中模板浓度太高了也会抑制PCR扩增啊？ ...

楼主上个模板DNA的电泳图，看看
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5楼2010-12-23 14:00:23
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独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 独孤蚕 at 2010-12-23 10:52:42:
我最近做了一个PCR，有的模板能扩出来，有的模板扩不出来，条件都是一样的，肯定就是模板的原因了。15μL体系，模板加3μL。有的模板很稠，吸不上来。问一下，是不是反应体系中模板浓度太高了也会抑制PCR扩增啊？ ...

一开始只加0.6微升的模板，没有扩出来，我以为DNA量太少了，需要就加大量了。唉！
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6楼2010-12-23 20:46:32
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独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)
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Originally posted by adslye at 2010-12-23 11:04:13:


你的是植物基因组？太稠了很可能不是基因组是多糖和基因组的混合物。多糖为主。总之，几乎不会出现提的基因组变成很粘稠，那太浓了。除非是大量浓缩的。

我的是动物的基因组。可能稀释时加水太少了还是蛋白质多的缘故？
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7楼2010-12-23 20:51:00
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 独孤蚕 at 2010-12-23 20:51:00:

    我的是动物的基因组。可能稀释时加水太少了还是蛋白质多的缘故？

动物一般蛋白质比较多，用酚氯仿抽提下。。
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8楼2010-12-23 20:54:23
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
最好还是上个DNA电泳图吧，看看
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9楼2010-12-23 20:54:44
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adslye

银虫 (正式写手)
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Originally posted by 独孤蚕 at 2010-12-23 20:51:00:

    我的是动物的基因组。可能稀释时加水太少了还是蛋白质多的缘故？

动物我就不清楚了，植物很可能是多糖。蛋白的话你跑胶应该能看到孔里有亮点。你有测OD值吗？

你测测浓度吧，如果光谱显示很浓，但是跑胶条带不是非常亮，那就是有污染了。因为基因组很亮的。

你的组织是什么？

我没做过动物，建议你把问题详细化。总有人能解答的。

帮顶~~~
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10楼2010-12-23 21:02:25
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